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鲤鱼鳞被发育相关基因EDA、EDAR克隆及表达定位初步研究

作　者: 王阳阳
导　师: 孙效文
学　校:
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 鲤鱼鳞被 RACE 整体原位杂交
分类号: S965.116
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

作为最重要的鲤科鱼类，鲤鱼是世界上养殖范围最广的淡水鱼类之一。镜鲤和普通鲤鱼是鲤鱼中常见的两个品种。在鱼类的养殖过程中，鳞被的特征是比较容易发现的。目前，对鳞被的研究很少，尤其在鲤鱼方面。长期的研究结果发现，镜鲤在肉质、生长速度等方面都显著优于建鲤，而二者最明显的性状在于皮肤表面覆盖的鳞被，而且鳞被在鱼类的抗病性研究中具有不可忽视的作用，并且有研究表明鱼类的鳞被与哺乳动物皮肤表面附属物，如毛发、汗腺甚至牙齿等有共同的进化祖先，因此从鲤鱼的鳞被入手。通过差异筛选出鳞被发育相关因子，本研究选取其中两个基因，进行克隆测序和功能分析，为应用基因工程技术提高鱼类尤其是哺乳动物毛发、汗腺等的研究，提供了更加丰富的优良候选基因。Ectodysplasin-A（EDA）基因最早是在哺乳动物中发现的，其在皮肤附属物的发育中具有重要的生物学功能。利用Genfishing差异筛选技术对普通鲤鱼和德国镜鲤的皮肤转录表达产物进行了筛选，得到EDA基因的部分片段。然后我们利用实验室的鲤鱼EST数据库设计包含CDS全长的特异引物。克隆测序后发现，镜鲤EDA基因全长CDS包含1062个碱基，编码一个含有354个氨基酸的蛋白质，包含一个受体结合位点序列。序列比对结果表明，鲤鱼EDA蛋白与斑马鱼相似度最高，达92.76%，而与其亲缘关系较远的鸡，人类，老鼠相似度较低，分别是46.61%，50.51%，50.76%。同时对RACE得到的5’-UTR区进行分析表明，该调控区与斑马鱼相比变异不大（相似度92.98%），但是与其亲缘关系较远的物种变异较大（与人类的相似度为23.36%，与老鼠的相似度为31.07%）。采用同样的方法得到EDAR基因的部分片段。通过克隆镜鲤mRNA全长发现，镜鲤该基因全长CDS包含1389个碱基，编码一个含有462个氨基酸的蛋白质，包含一个信号肽位点、肿瘤坏死因子受体结合位点序列、跨膜区和死亡结构域。序列比对结果表明，镜鲤EDAR蛋白与斑马鱼相似度最高，达88.31%，而与其亲缘关系较远的爪蟾，鸡，人类，老鼠相似度较低，分别是64.88%，63.79%，64.36%，63.50%。同时对RACE得到的5’-UTR和3’-UTR区进行分析表明，即使跟亲缘关系较近的斑马鱼和青鳉的差异也挺大（5’-UTR与斑马鱼、青鳉的相似度分别为23.78%，24.73%，3’-UTR与青鳉的相似度为35.49%），与其亲缘关系较远的物种变异更大（5’-UTR与非洲爪蟾、鸡、人和老鼠的相似度分别为11.73%、18%、6.50%、10.04%，3’-UTR与非洲爪蟾、人和老鼠的相似度分别为9.42%、8.05%、9.37%）。整体原位杂交结果表明，这两个基因在普通鲤和镜鲤鳞片发生时在鳞片着生的皮肤基质中特异表达，而在非鳞片发生区域表达较弱或者不表达，而在全部鳞片发育形成后，基因的表达消失，表明这两个基因可能参与鲤鱼鳞片的起始发育而不是后期的鳞片模式维持过程。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-11
第一章引言  11-19
  1 .1 鱼类的鳞  11-12
    1.1 .1 鳞的分类  11
    1.1.2 鱼鳞的发育模式  11-12
  1.2 鳞被发育过程研究进展  12-15
    1.2.1 鳞被发育研究的科学问题  12-13
    1.2.2 鳞被发育的未来趋势  13-15
  1.3 鲤鱼天然存在鳞被突变且稳定遗传的种群  15-16
    1.3.1 突变体遗传学方法解析鳞被发育过程  15-16
    1.3.2 鲤鱼中的天然突变体-镜鲤  16
  1.4 候选基因的研究进展  16-19
    1.4.1 基因 EDA 的研究进展  16-17
    1.4.2 基因 EDAR 的研究进展  17-19
第二章材料与方法  19-30
  2.1 实验用鱼的获得及喂养管理  19-21
  2.2 主要的仪器设备和试剂及其试剂盒  21-25
    2.2.1 主要的仪器设备  21
    2.2.2 主要试剂的配制和试剂盒的订购  21-25
  2.3 实验方法  25-30
    2.3.1 镜鲤各组织 RNA 的提取并反转录  25-26
    2.3.2 基因的克隆分析  26-30
第三章：结果  30-44
  3.1 基因在镜鲤各个组织中的表达  30
  3.2 基因 5，-UTR 和 3，-UTR 的克隆  30-34
    3.2.1 EDA 基因 5，端 UTR 区的克隆  30-31
    3.2.2 EDAR 基因 5，端 UTR 区的克隆  31-33
    3.2.3 EDAR 基因 3，端 UTR 区的克隆  33-34
  3.3 多物种 CDS 序列比对  34-39
    3.3.1 EDA 基因 CDS 的多物种比对  34-37
    3.3.2 EDAR 基因 CDS 的多物种比对  37-39
  3.4 构建进化树  39-41
    3.4.1 EDA 基因的氨基酸序列与其他物种构建进化树  39-40
    3.4.2 EDAR 基因的氨基酸序列与其他物种构建进化树  40-41
  3.5 基因在建鲤和镜鲤皮肤中的表达  41-44
    3.5.1 EDA 基因在建鲤和镜鲤皮肤中的表达  41-42
    3.5.2 EDAR 基因在建鲤和镜鲤皮肤中的表达  42-44
第四章讨论和结论  44-47
  4.1 讨论  44-46
    4.1.1 EDA 基因的分析  44-45
    4.1.2 EDAR 基因的分析  45-46
  4.2 结论  46-47
参考文献  47-53
硕士期间发表论文  53-56
致谢  56

鲤鱼鳞被发育相关基因EDA、EDAR克隆及表达定位初步研究

内容摘要

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