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油茶蛋白磷酸酶基因的全长cDNA克隆与序列分析

作　者: 刘巧
导　师: 谭晓风
学　校: 中南林业科技大学
专　业: 遗传学
关键词: 油茶蛋白磷酸酶 MPP PTP PP2C cDNA克隆 RACE
分类号: S794.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

可逆性蛋白磷酸化的发现是人类研究细胞信号转导工作中的里程碑。蛋白激酶和蛋白磷酸酶是催化可逆性蛋白磷酸化和脱磷酸的2种关键酶类。由蛋白磷酸酶所催化的脱磷酸化作用可以改变信号通路中许多关键蛋白质的生理生化特性,如酶催化活性以及蛋白质亚细胞定位等,从而影响细胞的增殖、分化和凋亡以及个体生长和发育。本论文主要研究结果如下：1)油茶蛋白磷酸酶基因的分离与鉴定。在本实验室已构建的油茶cDNA文库中,鉴定出四条PPase基因,其中1条为MPP基因,长度1436bp；1条为PTP基因,长1067bp；2条为PP2C基因,分别长823bp和1501bp；除最后一条PP2C基因外,它们均含有poly(A)。将此四条cDNA序列经过经过在线翻译并同其它物种的同类蛋白质序列进行比对发现,MPP基因第194-982bp属于编码区,对应其他物种的同种蛋白质的首位至末位氨基酸,相似性很高,推断此cDNA克隆是蛋白磷酸酶MPP基因全长,命名为CoMPP1基因；PTP基因第9-878bp属于编码区,对应于其它物种的同种蛋白质的第16或第45个氨基酸至末位氨基酸,相似性很高,推断此cDNA克隆是蛋白磷酸酶PTP基因的部分序列,其5’端缺失了编码约16～45个氨基酸残基及非编码区的cDNA序列,命名为CoPTPl基因；长度为823bp的PP2C基因第1-518bp属于编码区,对应于其它物种的同种蛋白质的第240个氨基酸至末位氨基酸,相似性很高,推断此cDNA克隆是蛋白磷酸酶PP2C基因部分序列,其5’端缺失了编码约240个氨基酸残基及非编码区的cDNA序列,命名为COPP2C1;另一条PP2C基因第2～1162bp属于编码区,对应于其它物种的同种蛋白质的第12个氨基酸至末位氨基酸,相似性很高,推断此cDNA克隆是蛋白磷酸酶PP2C基因部分序列,其5’端缺失了编码约12个氨基酸残基及非编码区的cDNA序列,3’端缺失了部分非编码区cDNA序列,命名为CoPP2C2。2)油茶蛋白磷酸酶基因的全长cDNA克隆。以优良无性系湘林1号种子为材料提取RNA,将其反转录的cDNA作为模板,根据实验室已构建的EST文库核苷酸序列片段以及从油茶近成熟种子cDNA文库中分离鉴定出的三条不完整的PPase基因片段进行拼接,用专业软件Primer Premier 5.0设计RACE特异引物,通过RACE技术扩增出蛋白磷酸酶CoPTP1基因和CoPP2C1基因的完整5’端,克隆产物经过插入pMD18-T载体,以及转化大肠杆菌DH5α菌株等一系列操作之后送至生物公司测序,克隆片断测序结果通过Vector NTI 9.0等生物信息学软件的分析,相互之间有序的拼接,获得了1170bp的CoPTP1基因和1453bp的CoPP2C1基因的全长cDNA序列。3)油茶蛋白磷酸酶的生物信息学分析。通过生物信息学软件Vector NTI 9.0对测序结果进行分析：CoMPP1基因cDNA长度1436bp,含有一个786bp的ORF,编码262个氨基酸,5’端和3’端非编码区分别为193bp、454bp; CoPTPl基因cDNA长度1170bp,含有一个927bp的ORF,编码309个氨基酸,5端、3端非编码区分别长51bp、189bp; CoPP2C1基因cDNA序列长1453bp,含有一个1113bp的ORF,编码371个氨基酸,5’端、3端非编码区分别为48bp和289bp。在GenBank序列BLAST比对获知三条蛋白磷酸酶CoMPP1、CoPTP1和CoPP2C1与其它物种的同种蛋白序列相似性分别达到84%、71%、79%。根据三条蛋白磷酸酶基因的cDNA序列推导出蛋白质的氨基酸序列,应用一系列生物信息学软件对理化性质、高级结构等进行预测分析,结果显示：CoMPP1蛋白等电点5.17,分子量29.7kDa,不稳定系数32.82,脂肪系数77.75；CoPTPl蛋白等电点7.56,分子量34.7kDa,不稳定系数45.99,脂肪系数103.73；CoPP2C1蛋白等电点5.33,分子量40.2kDa,不稳定系数53.73,脂肪系数80.35；三个磷酸酶均无跨膜结构区域,无信号肽位点,是非分泌蛋白。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-9
缩略词  9-14
1 绪言  14-26
  1.1 蛋白磷酸酶的分类、结构和功能  14-24
    1.1.1 丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶的分类  15-16
    1.1.2 酪氨酸蛋白磷酸酶的分类  16
    1.1.3 蛋白磷酸酶的结构  16-20
    1.1.4 蛋白磷酸酶的生物学功能  20-24
  1.3 本研究的目的意义  24
  1.4 本研究的主要内容和技术路线  24-26
2 油茶蛋白磷酸酶MPP基因全长CDNA克隆  26-35
  2.1 材料与方法  26-28
    2.1.1 材料  26-27
    2.1.2 实验方法  27-28
  2.2 结果与分析  28-34
    2.2.1 重组子PCR检测电泳结果  28
    2.2.2 油茶MPP基因全长cDNA的获得  28
    2.2.3 CoMPP1核酸序列分析  28-29
    2.2.4 CoMPP1蛋白质序列分析  29-34
  2.3 讨论  34-35
3 油茶蛋白磷酸酶PTP基因全长CDNA克隆  35-54
  3.1 材料和方法  35-36
    3.1.1 材料  35-36
    3.1.2 主要试剂  36
    3.1.3 主要仪器和用品  36
    3.1.4 实验方法  36
  3.2 PTP基因全长cDNA克隆与分析  36-45
    3.2.1 油茶种子胚乳总RNA提取  36-37
    3.2.2 电泳检测  37
    3.2.3 mRNA反转录获得cDNA  37-38
    3.2.4 PTP基因的5'RACE PCR  38-42
    3.2.5 目的片段回收  42-43
    3.2.6 感受态细胞的制备  43
    3.2.7 T载体重组子的制备  43-44
    3.2.8 重组子转化  44
    3.2.9 PCR鉴定重组子  44-45
    3.2.10 PCR产物测序  45
  3.3 PTP基因克隆结果电泳检测  45-46
    3.3.1 油茶种子总RNA的提取质量  45
    3.3.2 PTP基因5'RACE产物龟泳检测  45-46
  3.4 油茶CoPTP1基因的生物信息学分析  46-53
    3.4.1 CoPTP1核苷酸序列分析  46-47
    3.4.2 CoPTP1蛋白质序列分析  47-53
  3.5 讨论  53-54
4 油茶蛋白磷酸酶PP2C基因全长CDNA克隆  54-65
  4.1 材料和方法  54-55
    4.1.1 材料  54
    4.1.2 主要试剂  54
    4.1.3 主要仪器和用品  54-55
    4.1.4 实验方法  55
  4.2 PP2C基因全长cDNA克隆与分析  55-57
    4.2.1 油茶胚乳总RNA提取、电泳检测、mRNA反转录  55
    4.2.2 PP2C的文库片段菌液PCR  55-56
    4.2.3 CoPP2C1基因的5'RACE  56-57
  4.3 CoPP2C1基因克隆结果电泳检测  57
  4.4 PP2C的生物信息学分析  57-64
  4.5 讨论  64-65
    4.5.1 核苷酸序列分析  64
    4.5.2 氨基酸序列分析  64-65
5 结论与创新  65-66
  5.1 结论  65
  5.2 创新  65-66
参考文献  66-72
附录A 实验药品  72-74
附录B 主要仪器设备  74
附录C 硕士研究生阶段发表的论文  74-75
致谢  75-76
课题来源  76

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中图分类: > 农业科学 > 林业 > 森林树种 > 特用阔叶树类 > 油茶
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