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毒死蜱对凡纳滨对虾的毒性效应研究

作　者: 刘强
导　师: 房文红
学　校: 上海海洋大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 毒死蜱凡纳滨对虾乙酰胆碱酯酶免疫相关基因荧光定量PCR WSSV
分类号:
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

为了对毒死蜱的毒性做出安全性评价，本文以凡纳滨对虾为实验动物，研究了毒死蜱对凡纳滨对虾幼虾（4.88±0.11g）和成虾（10.27±0.41g）的急性毒性。实验结果显示，毒死蜱浓度越高，死亡时间出现越早；毒死蜱对凡纳滨对虾幼虾的24hLC50、48hLC50、72hLC50和96hLC50分别为3.948μg/L、2.695μg/L、1.320μg/L和0.758μg/L，安全浓度为0.0758μg/L；毒死蜱对凡纳滨对虾成虾的24hLC50、48hLC50、72hLC50和96hLC50分别为5.743μg/L、3.688μg/L、2.437μg/L和1.951μg/L，安全浓度为0.195μg/L。按照农药毒性分级标准，毒死蜱对凡纳滨对虾属剧毒性农药。另外，和幼虾相比，成虾对毒死蜱的敏感性较低。为进一步评价养殖水环境中毒死蜱对凡纳滨对虾生存的危害性，本研究开展了毒死蜱胁迫下白斑综合征病毒（WSSV）对凡纳滨对虾致死实验，分析了毒死蜱胁迫下WSSV在凡纳滨对虾鳃组织增殖规律和肌肉组织乙酰胆碱酯酶活性变化情况。在上述急性毒性实验的基础上，确定了毒死蜱胁迫实验浓度为0.2μg/L，此浓度下药浴4d后对凡纳滨对虾注射WSSV，结果显示：毒死蜱胁迫下注射WSSV组的对虾死亡率（83.33%±4.7%）极显著高于乙醇-WSSV组（40%±0.9%）；荧光定量PCR检测对虾鳃组织WSSV含量显示：感染72h后，毒死蜱-WSSV组WSSV含量约是乙醇-WSSV组的4倍；感染96h后，毒死蜱-WSSV组WSSV含量显著增加，约是72h毒死蜱-WSSV组的4.9倍，是96h乙醇-WSSV对照组的5.9倍。毒死蜱胁迫下，对虾肌肉组织乙酰胆碱酯酶（AChE）活性低于对照组20%左右。由此可见，毒死蜱胁迫下，WSSV增殖速率加快，导致对虾死亡率升高。为进一步探究毒死蜱对凡纳滨对虾的毒理学机制，本研究从免疫学的角度，检测了亚致死剂量毒死蜱短期内对凡纳滨对虾免疫相关基因表达变化的影响。首先在上述急性毒性实验的基础上，本实验选择了毒死蜱药浴浓度为1/296hLC50（0.38μg/L），分析了对虾鳃和肌肉AChE活性的变化，然后通过荧光定量PCR检测了毒死蜱药浴4天对虾鳃组织中酚氧化酶（PO）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、溶菌酶（LyZ）和对虾素（Penaeidin-3a）基因随时间的表达变化。结果显示：0.38μg/L毒死蜱药浴4天期间，对虾没有出现狂游，身体抽搐等有机磷中毒的典型症状，没有出现对虾死亡。同时毒死蜱药浴24h、48h、72h、96h后，和对照组相比，除了鳃组织96hAChE活性被抑制15%左右，其他各时间点对虾鳃和肌肉乙酰胆碱酯酶活性均没有出现显著性差异；荧光定量PCR检测结果显示：受毒死蜱影响，对虾PO mRNA表达水平显著上调，除0h外，其他四个时间点分别是对照组PO表达水平的1.38倍，1.54倍，1.95倍和1.40倍；对虾SOD表达量开始上升，至48h达到最大，约是对照组SOD表达量的2.5倍，之后逐渐下降到正常水平；对虾LyZ mRNA表达量从24h到72h逐渐上升，72h达到最大值，约是对照组的2.24倍，之后下降；对虾Penaeidin-3a的表达水平48h达到最高，约是对照组的2.14倍，之后逐渐下降接近正常水平；毒死蜱药浴24h后CAT表达水平与对照组CAT水平基本一致，48h到72h，CAT表达水平逐渐上升，至72h表达水平约是对照组的1.66倍，96h表达水平出现下降。综上所述，毒死蜱对凡纳滨对虾属于剧毒农药。在相同的实验条件下，毒死蜱对幼虾的毒性要更强。毒死蜱胁迫下，凡纳滨对虾感染WSSV后，死亡率显著升高，启示我们，实际生产中，毒死蜱的施用与残留应该不时地进行管制和检测，使毒死蜱的浓度尽可能处于养殖生物的安全浓度。亚致死剂量的毒死蜱可激活凡纳滨对虾的免疫系统的某些免疫反应，使免疫相关基因表达获得上调，为毒死蜱毒理学机制提供了有益的数据。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-11
第一章引言  11-18
  1.1 毒死蜱的理化性质  11
  1.2 毒死蜱的使用现状，对环境的危害  11-12
  1.3 毒死蜱对水生动物的急性毒性  12
  1.4 毒死蜱对水生动物的慢性毒性  12-14
    1.4.1 对生长、呼吸、行为的影响  13
    1.4.2 对生殖能力和胚胎发育的影响  13-14
  1.5 毒死蜱的机体代谢  14
  1.6 毒死蜱在环境中的降解  14-16
    1.6.1 毒死蜱在水体中的降解  14-15
    1.6.2 毒死蜱在土壤中的吸附与降解  15
    1.6.3 毒死蜱的微生物降解  15-16
  1.7 联合毒性效应  16-17
  1.8 本研究的目的与意义  17-18
第二章毒死蜱对凡纳滨对虾急性毒性研究  18-27
  2.1 材料和方法  18-20
    2.1.1 材料  18-19
      2.1.1.1 实验动物  18-19
      2.1.1.2 试剂  19
    2.1.2 方法  19
      2.1.2.1 毒死蜱对凡纳滨对虾幼虾急性毒性实验  19
      2.1.2.2 毒死蜱对凡纳滨对虾成虾急性毒性实验  19
    2.1.3 数据处理与分析  19-20
  2.2 结果  20-24
    2.2.1 凡纳滨对虾毒死蜱中毒后的反应状况  20
    2.2.2 毒死蜱对凡纳滨对虾幼虾的急性毒性  20-22
    2.2.3 毒死蜱对凡纳滨对虾成虾的急性毒性  22-24
  2.3 讨论  24-27
第三章毒死蜱胁迫下 WSSV 对凡纳滨对虾的致病性研究  27-35
  3.1 材料和方法  27-31
    3.1.1 材料  27-28
      3.1.1.1 实验动物  27
      3.1.1.2 试剂与仪器  27-28
      3.1.1.3 主要化学试剂的配制  28
    3.1.2 方法  28-30
      3.1.2.1 毒死蜱胁迫浓度的确定  28-29
      3.1.2.2 毒死蜱胁迫下凡纳滨对虾感染 WSSV 实验  29
      3.1.2.3 毒死蜱胁迫下对虾体内乙酰胆碱酯酶活性测定  29-30
      3.1.2.4 毒死蜱胁迫下对虾体内 WSSV 增殖实验  30
    3.1.3 数据处理与分析  30-31
  3.2 结果  31-33
    3.2.1 毒死蜱与 WSSV 协同对凡纳滨对虾致死作用  31-32
    3.2.2 毒死蜱药浴对凡纳滨对虾乙酰胆碱酯酶活性的影响  32
    3.2.3 毒死蜱胁迫下凡纳滨对虾体内 WSSV 的增殖  32-33
  3.3 讨论  33-35
第四章毒死蜱对凡纳滨对虾免疫相关基因表达的影响  35-47
  4.1 材料与方法  35-39
    4.1.1 实验材料  35-36
      4.1.1.1 实验动物  35
      4.1.1.2 试剂与仪器  35-36
      4.1.1.3 主要化学试剂的配制  36
    4.1.2 实验方法  36-38
      4.1.2.1 毒死蜱药浴浓度的确定  36
      4.1.2.2 样本采集与处理  36
      4.1.2.3 AChE 活性测定  36
      4.1.2.4 总 RNA 提取与 cDNA 合成  36-38
      4.1.2.5 荧光定量 PCR  38
    4.1.3 数据处理与分析  38-39
  4.2 结果  39-43
    4.2.1 凡纳滨对虾乙酰胆碱酯酶(AChE)活性变化  39-40
    4.2.2 荧光定量 PCR 检测凡纳滨对虾免疫相关基因表达水平  40-43
  4.3 讨论  43-47
结论  47-48
参考文献  48-58
附录  58-59
致谢  59

毒死蜱对凡纳滨对虾的毒性效应研究

内容摘要

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