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鸡催乳素和新城疫病毒F基因疫苗联合免疫研究

作　者: 周梅仙
导　师: 茆达干
学　校: 南京农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 地方草鸡 催乳素 新城疫 融合蛋白 免疫应答
分类号: S852.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


PRL是禽类就巢发生和维持的关键激素,F蛋白是新城疫病毒的主要宿主免疫保护性抗原。主动免疫鸡催乳素(Prolactin, PRL)和新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV) F基因既可改变雌禽的繁殖性能,提高产蛋量,又可改善免疫性能。本研究应用基因克隆、细胞培养、基因免疫、蛋白印迹等技术,构建鸡催乳素和新城疫病毒(NDV) FDNA重组表达质粒,为研制鸡催乳素和新城疫基因疫苗奠定了基础。1、鸡PRL和NDV F基因的原核表达与免疫特性鉴定将鸡催乳素和NDV F基因克隆于pGEX-6P-1载体中,转化大肠杆菌BL21用0.5mM IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳结果分析PRL、F基因获得高量表达,大小分别约为54kDa和86kDa,与预期结果相符,表达产物以融合蛋白包涵体的形式出现在沉淀中。Western blot结果表明,融合表达的GST-PRL和GST-F蛋白能与小鼠血清发生特异性反应,证明其抗原性良好。经包涵体洗液裂解后得到纯化蛋白GST-PRL和GST-F分别免疫ICR小鼠,获得多克隆抗体,从而为PRL和F蛋白功能研究奠定了基础。2、共表达PRL和NDV F基因的真核质粒构建与鉴定本研究成功构建了重组真核质粒pVAX-PRL、pVAX-NDV F和pVAX-PRL-F,酶切及测序鉴定正确。然后将这些重组真核质粒用脂质体法转染HEK-293A细胞,通过Western blot,可以检测到目的蛋白,为上述3个重组真核质粒的进一步应用奠定了基础。3、PRL和NDV F蛋白真核表达质粒对鸡生产性能和免疫特性研究150日龄150只地方土鸡随机分为5组,每组30只。第1组为阴性对照组,注射PBS,第2、3、4、5组分别腿部肌肉注射免疫pVAX、pVAX-PRL、pVAX-F和pVAX-PRL-F,剂量为每只鸡免疫100μg,21、42天后分别以相同的剂量加强免疫。结果显示,三次免疫后3周免疫重组真核质粒pVAX-PRL-F组,血清ELISA抗体等水平是最高的。免疫后pVAX-PRL和pVAX-PRL-F组就巢天数比对照组和pVAX组降低了0.8和13.8天(P<0.05),300日龄平均产蛋总数pVAX-PRL和pVAX-PRL-F组增加了8.6和16.4个(P<0.05),在免疫后38和42周,pVAX-PRL和pVAX-PRL-F组血清中PRL水平较对照组和pVAX组显著降低,三次免疫后3周免疫pVAX-PRL-F组有较高的淋巴细胞特异性的增殖,且IL-4及IFN-γ含量较其他组均有差异显著(P<0.05)。这些结果表明,PRL和NDV F蛋白真核表达质粒免疫鸡可以提高产蛋性能和免疫特性,为研制鸡催乳素和新城疫基因疫苗奠定了基础。

全文目录


摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
第一章 鸡催乳素、新城疫和DNA疫苗的研究进展  11-21
  1.1 鸡催乳素的研究概况  11-13
  1.2 鸡新城疫的研究概况  13-15
  1.3 DNA疫苗研究进展  15-16
  参考文献  16-21
第二章 鸡PRL和NDV F基因的原核表达与免疫特性鉴定  21-33
  1 材料与方法  21-28
    1.1 载体和菌株  21
    1.2 试剂和酶类  21-22
    1.3 鸡PRL和新城疫F基因片段引物的设计与合成  22
    1.4 PRL和NDV F基因PCR扩增及纯化  22-25
    1.5 PRL、NDV F原核表达重组质粒的构建、表达及重组蛋白的纯化  25-27
    1.6 PRL和NDV F蛋白多克隆抗体制备  27-28
    1.7 Western blot  28
  2. 结果  28-31
    2.1 PRL和NDV F基因片段重组质粒的构建  28-29
    2.2 PRL和NDV F重组蛋白表达与Western blot鉴定  29-31
  3 讨论  31-32
  参考文献  32-33
第三章 共表达PRL和NDV F基因的真核质粒构建鉴定  33-45
  1 材料  33-34
    1.1 质粒、菌株  33
    1.2 试剂  33-34
  2 方法  34-39
    2.1 PRL及NDV F基因的扩增  34-35
    2.2 PRL和NDV F基因的回收纯化  35
    2.3 重组真核质粒构建  35-38
    2.4 重组质粒的真核表达鉴定  38-39
  3 结果  39-41
    3.1 重组真核质粒的构建与鉴定  39-40
    3.2 Western blot鉴定蛋白的表达  40-41
  4 讨论  41-42
  参考文献  42-45
第四章 体外表达PRL和NDV F蛋白真核质粒对鸡生产性能和免疫特性研究  45-57
  1 材料  45-46
    1.1 质粒与病毒  45-46
    1.2 主要试剂  46
  2 方法  46-49
    2.1 质粒的大量制备  46
    2.2 动物分组与免疫实验  46-47
    2.3 鸡产蛋性能和血清中PRL含量测定  47
    2.4 ELISA抗体检测  47-48
    2.5 淋巴细胞增殖实验  48
    2.6 细胞因子测定  48
    2.7 数据统计分析  48-49
  3 结果  49-52
    3.1 免疫后鸡就巢概况和产蛋性能  49
    3.2 免疫后鸡血清中PRL变化规律  49-50
    3.3 体液免疫应答  50-51
    3.4 细胞免疫应答  51-52
  4 讨论  52-54
  参考文献  54-57
全文总结  57-59
致谢  59

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜免疫学
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