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HEp-2细胞hPOT1高表达上调P21Waf1/Cip1表达的研究

作　者: 黄璐
导　师: 李一荣；胡丽华
学　校: 华中科技大学
专　业: 临床检验诊断学
关键词: hPOT1 pEGFP-C2 端粒 P21Waf1/Cip1 MDM2 P53 GFP-hPOT1融合蛋白
分类号: R733.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


目的:构建真核表达质粒pEGFP-C2-hPOT1。方法:采用TRIzol从慢性粒细胞白血病K562细胞中提取总RNA,并将总RNA逆转录成cDNA后采用高保真的Taq酶对hPOT1进行扩增,随后将扩增产物插入真核表达载体pEGFP-C2,构建真核表达质粒pEGFP-C2-hPOT1,转化大肠杆菌,采用基因测序等方法鉴定pEGFP-C2-hPOT1。结果:真核表达质粒pEGFP-C2-hPOT1经测序确认未发生碱基突变与移码,且与GeneBank中hPOT1的参考序列（NM015450.2）完全匹配。结论:成功构建真核表达质粒pEGFP-C2-hPOT1目的:研究HEp-2细胞hPOT1高表达对P21Waf1/Cip1表达水平的影响及其可能的机制。方法:①实时荧光定量PCR分别检测实验组（HEp-2细胞转染pEGFP-C2-hPOT1）和对照组（HEp-2细胞转染pEGFP-C2）hPOT1 mRNA和P21 mRNA的水平;②激光共聚焦显微镜检测GFP-hPOT1融合蛋白及MDM2在HEp-2细胞中的定位;③Western blot检测实验组和对照组中GFP-hPOT1融合蛋白、MDM2、P53、P21Waf1/Cip1等蛋白的表达水平。结果:①当使用4μg质粒转染HEp-2细胞24hr和48hr时,实验组hPOT1 mRNA水平分别为对照组的92233.29和25870.14倍,且仅有98KD大小的GFP-hPOT1融合蛋白的表达,而对照组表达27KD大小的GFP蛋白;②HEp-2细胞中的GFP-hPOT1融合蛋白主要定位于细胞核中,但细胞浆中也存在少量的GFP-hPOT1融合蛋白;③实验组与对照组中P21 mRNA的水平差异不明显,但实验组中P21Waf1/Cip1的水平显著高于对照组,且随着pEGFP-C2-hPOT1转染量的增加,GFP-hPOT1融合蛋白的表达量不断增加,P21Waf1/Cip1的表达量随着GFP-hPOT1融合蛋白的增加而不断上调;④实验组MDM2表达水平明显高于对照组,但两组间P53水平变化不明显;⑤实验组GFP- hPOT1融合蛋白与MDM2能够共同定位于同一位点。结论:HEp-2细胞中hPOT1的高表达导致P21Waf1/Cip1的表达水平上调,并且呈现对GFP-hPOT1融合蛋白的剂量依赖性;同时在HEp-2细胞中hPOT1能够与MDM2共同定位于同一位点;hPOT1的高表达致P21Waf1/Cip1表达水平的上调不是通过增加P21 mRNA的水平、而可能是通过抑制MDM2的E3连接酶活性从而抑制蛋白酶体降解P21Waf1/Cip1所致。

全文目录


英文缩略词  5-6
中文摘要  6-8
Abstract  8-10
第一部分 真核表达质粒pEGFP-C2-hPOT1 的构建  10-25
  引言  10
  实验材料  10-13
  实验方法  13-19
  实验结果  19-23
  讨论  23-24
  参考文献  24-25
第二部分 HEp-2 细胞hPOT1 高表达上调P21Waf1  25-46
  引言  25-26
  实验材料  26-30
  实验方法  30-35
  结果  35-40
  讨论  40-43
  参考文献  43-46
结论  46-47
综述  47-55
  参考文献  52-55
致谢  55

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 造血器及淋巴系肿瘤 > 白血病
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