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DOG融合蛋白对缺氧CT26细胞中Notch信号的阻断作用

作　者: 何爱丽
导　师: 赵林川
学　校: 苏州大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 缺氧 DOG融合蛋白 Notch信号 结肠癌
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


体外研究表明,缺氧促进肿瘤细胞的侵袭和转移与Notch信号有关。为了探讨结肠癌缺氧区细胞中的Notch信号与肿瘤体内生长的关系,本研究构建了特异性阻断缺氧细胞中Notch信号的DOG融合蛋白表达载体。论文主要涉及以下内容,首先,分别构建了DNMAML1-GFP、ODD-DNMAML1-GFP ( ODG )和DNMAML1-ODD-GFP(DOG)三种不同的融合蛋白表达载体。其次,将上述融合蛋白表达载体转入293T人胚肾细胞,借助荧光显微镜,观察不同融合蛋白在正常氧和缺氧细胞中的表达,发现DOG融合蛋白的稳定存在依赖于缺氧环境。然后,通过逆转录病毒介导DOG融合蛋白在CT26结肠癌细胞中表达,借助荧光显微镜观察荧光强度,应用Western印迹和实时荧光定量PCR(real-time fluorogentic quantitative-PCR, RFQ-PCR)等方法验证DOG融合蛋白对缺氧的依赖性和抑制Notch信号的能力。最终,通过失巢凋亡实验和小鼠体内肿瘤形成实验,探讨了DOG融合蛋白对CT26结肠癌细胞的生物学作用。1.成功构建了DNMAML1-GFP、ODG和DOG三种不同的融合蛋白表达载体酶切和测序结果表明,构建DNMAML1-GFP、ODG和DOG三种不同的融合蛋白表达载体获得成功。2.DOG融合蛋白在缺氧的293T细胞中表达增强因为DNMAML1、ODD和GFP为融合蛋白,故293T细胞中绿色荧光的强弱可以初步反映融合蛋白表达量的多少。荧光显微镜下观察DNMAML1-GFP、DOG、ODG三种融合蛋白在正常氧和缺氧细胞中的表达情况,结果发现DOG融合蛋白在缺氧细胞中的表达明显增强。3.在结肠癌细胞(CT26)中DOG融合蛋白的稳定存在依赖于缺氧条件成功获得逆转录病毒感染的CT26稳定细胞系(MID-DOG/CT26和MID-GFP/ CT26)。在荧光显微镜下观察,发现DOG融合蛋白的稳定存在依赖于缺氧环境,Western印记法同样表明DOG融合蛋白只在缺氧的CT26细胞中存在。4.DOG融合蛋白特异性抑制缺氧CT26细胞中的Notch信号利用RFQ-PCR检测Notch信号下游靶基因Hes1 mRNA的表达水平。与GFP对照相比,DOG融合蛋白对正常CT26细胞中Hes1 mRNA水平无明显影响,该蛋白显著降低缺氧CT26细胞中Hes1 mRNA水平(P <0.01)。上述结果表明,DOG融合蛋白能够特异性抑制缺氧CT26细胞中的Notch信号。5.DOG融合蛋白促进缺氧的CT26细胞体外的失巢凋亡与对照相比,DOG融合蛋白对正常CT26细胞的失巢凋亡没有明显影响,却促进缺氧CT26细胞的失巢凋亡(P <0.01)。6.DOG融合蛋白抑制CT26细胞在BALB/c小鼠体内生长体内成瘤实验表明,与GFP对照蛋白相比,DOG融合蛋白抑制CT26细胞在小鼠体内成瘤;小鼠接种MID-DOG/CT26细胞21天后,肿瘤组织的质量明显低于MID-GFP/CT26对照组(P <0.01)。通过上述结果,我们得出以下结论:DOG融合蛋白特异性阻断缺氧CT26细胞中的Notch信号;结肠癌缺氧区细胞中的Notch信号促进肿瘤体内生长。

全文目录


中文摘要  4-6
Abstract  6-10
引言  10-11
第一部分 文献综述  11-19
  第一章 结直肠癌的发生发展与缺氧的关系  11-14
    1 缺氧在肿瘤发生发展中的重要性  11
    2 肿瘤组织内形成缺氧区域的原因  11
    3 哺乳动物细胞对缺氧的反应机制  11-12
    4 缺氧促进结直肠癌的发生发展  12
    5 缺氧促进结直肠癌发生发展的可能机制  12-13
    6 展望  13-14
  第二章 Notch 信号通路  14-19
    1 Notch 信号通路的组成及活化  14-15
    2 Notch 信号通路的激活  15
    3 阻断Notch 信号通路的方法  15-16
    4 Notch 信号通路的生理作用  16
    5 Notch 信号通路与其他信号通路的相互作用  16-17
    6 Notch 信号通路与肿瘤的关系  17-18
    7 展望  18-19
第二部分 实验研究  19-55
  第三章 研究目的与技术路线  19-20
    1 研究目的  19
    2 技术路线  19-20
  第四章 实验材料与方法  20-40
    1 实验材料  20-22
    2 实验方法  22-40
  第五章 结果与分析  40-51
    1 DNMAML1-GFP, DOG, ODG 融合蛋白逆转录病毒表达载体的构建  40-45
    2 选择DOG 融合蛋白作为进一步研究的对象  45-47
    3 DOG 融合蛋白特异性阻断缺氧CT26 细胞中的Notch 信号  47-49
    4 DOG 融合蛋白对CT26 细胞的生物学效应  49-51
  第六章 讨论  51-54
  第七章 结论与展望  54-55
参考文献  55-63
研究生期间发表文章  63-64
附录 主要缩略语  64-65
附录 测序结果  65-68
致谢  68-69

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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