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下丘脑AMPK及mTOR通路在LPS诱导厌食中的作用

作　者: 岳云双
导　师: 林海
学　校: 山东农业大学
专　业: 动物营养与饲料科学
关键词: LPS 采食量 NF-кB AMPK mTOR 下丘脑小鼠
分类号: S852.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

本课题研究了腹腔注射菌体脂多糖（LPS），激活核因子（NF-кB）信号通路对食欲调节机制的影响。通过对LPS诱导厌食机制的研究，筛选出调节采食的关键基因及蛋白，从而确定了采用中枢灌注药物的方法，干预LPS诱导的动物厌食，为改善LPS诱导的动物厌食提供理论依据。试验一：体重相近的8周龄健康小鼠24只，随机均分成4组，饲养在环境控制的鼠房内，室内温度控制在23±0.1自由采食和饮水。试验期，小鼠禁食24小时后，分别按照0，10，100，1000μg/kg体重的剂量腹腔注射LPS。分别记录注射后1、2、4、6、12、24小时的采食量及体重。结果发现：与对照组相比，LPS处理的所有时间点的采食量均显著降低（p<0.01），处理组内小鼠24h的体重也显著降低，但24小时以后，10μg及100μg处理组的小鼠的体重均出现了恢复；在LPS处理组中，随着LPS浓度的增加，动物的采食量和体重显著降低。以上结果表明：LPS能够降低动物的采食和体重，并且呈现剂量依赖性。试验二：8周龄体重相近的健康小鼠36只，随机均分成4组，饲养在环境控制的鼠房内，温度控制在23±0.1由采食和饮水。试验前，所有小鼠禁食24h后，于18:00点分别按照0，100，500μg/kg体重的剂量腹腔注射LPS。注射LPS2小时后，将小鼠颈部移位处死，并迅速剥离下丘脑，进行样品分析。试验结果表明：LPS处理显著的提高了下丘脑内抑制食欲的基因POMC的mRNA水平（p<0.05）。利用Western Bloting技术测定下丘脑内FoxO1的磷酸化水平，发现FoxO1在Ser256和Thr24/FoxO3a (Thr32)位点的磷酸化水平显著上调（p<0.05），并且显著增强了细胞浆内FoxO1的水平（p<0.05）；在测定细胞因子的基因表达量时，发现LPS处理显著提高了IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA水平（p<0.05）；NF-кB蛋白磷酸化测定过程中，发现LPS处理显著地提高了NF-кB在Ser536位点的磷酸化水平（p<0.05），同时细胞核内NF-кB在该位点的磷酸化水平也显著提高；除此之外，AMPK在Thr172位点的磷酸化水平显著下调，而mTOR在Ser2448位点及P70S6K在Thr389位点的磷酸化水平均显著上调。上述结果提示：LPS处理可能是通过增加细胞因子的释放，从而激活NF-кB信号通路，引起食欲基因的变化，而影响动物的采食量；另外，AMPK以及mTOR信号可能也参与了LPS引起的动物厌食。试验三：试验选用体重相近的8周龄雄性昆明小鼠24只，随机均分为A、B、C、D4个组。禁食24小时后，于18:00点A、C组小鼠脑室注射人工脑脊液（artificialcerebrospinal fluid，ACSF），B、D组小鼠脑室注射AICAR。脑室注射1小时后，A、B组小鼠再腹腔注射LPS（500μg/kg BW），C、D两组注射生理盐水，记录采食量。样品采集：在小鼠腹腔注射2h后，将小鼠颈部移位处死，随后迅速剥离下丘脑，进行样品分析。结果显示：脑室注射AICAR没有影响LPS组小鼠的采食量（p>0.05），提示AMPK信号通路可能不是LPS诱导动物厌食中的关键通路。试验四：体重相近的8周龄雄性昆明小鼠24只，单笼饲养，饲喂基础日粮，自由饮水。试验期将小鼠随机平均分成A、B、C、D四个组。所有小鼠提前禁食24h后，于18:00点，A、C组脑室注射人工脑脊液1μl，C、D组按照20μg/μl的剂量脑室注射mTOR阻断剂Rapamycin1μl。脑室注射1小时后，B、D组按照500μg/kg体重的剂量腹腔注射LPS，另外两组注射同剂量的生理盐水。记录1，2，4，6，12，24小时的采食量。样品采集：在小鼠腹腔注射2h后，将小鼠颈部移位处死，随后迅速剥离下丘脑，进行样品分析。由结果可知：脑室注射Rapamycin显著提高了LPS诱导的厌食小鼠的采食量（p<0.05），显著的下调了抑食基因POMC的mRNA水平（p<0.05），显著的提高了NPY/AgRP的mRNA水平（p<0.05）；测定细胞因子的mRNA水平发现，脑室注射Rapamycin，显著降低了细胞因子IL-1α、TNF-α的mRNA水平(p<0.05)，IL-1β的mRNA水平呈现下调的趋势，而IL-6的mRNA水平没有显著的变化；另外，Rapamycin处理显著降低了LPS诱导的FoxO1、NF-кB、mTOR、P70S6K的高磷酸化水平（p<0.05）。以上所述结果提示：Rapamycin可能是通过降低细胞因子的释放水平，使得调节食欲基因表达的蛋白的功能的恢复，从而食欲基因的表达得到改善，继而使LPS诱导的小鼠的采食量增加。

全文目录

缩略词  4-9
中文摘要  9-11
Abstract  11-14
1 前言  14-28
  1.1 厌食的定义及其影响  15-16
  1.2 诱导厌食的因素  16-18
    1.2.1 常见的细菌性感染致病原-LPS  16
    1.2.2 炎症细胞因子的种类及作用  16-18
  1.3 NF-кB 信号通路  18-19
    1.3.1 NF-кB 家族  18
    1.3.2 NF-кB 信号通路的功能  18-19
  1.4 中枢神经系统的采食调控  19-23
    1.4.1 下丘脑的采食调控  19-21
    1.4.2 FoxO 蛋白家族在采食调控中的作用  21-23
  1.5 细胞因子对采食中枢的调控作用  23-24
  1.6 AMPK 信号通路在采食调控中的作用  24-26
  1.7 mTOR 信号通路在采食调控中的作用  26-27
  1.8 本课题的研究目的与意义  27-28
2 材料和方法  28-50
  2.1 试验材料  28-31
    2.1.1 试验动物与日粮  28
    2.1.2 试验试剂与仪器  28-31
  2.2 试验方法  31-49
    2.2.1 构建 LPS 刺激导致的动物厌食模型（试验一）  31
    2.2.2 研究 LPS 构建的动物模型中，激活 NF-кB 信号通路对食欲调节机制的影响(试验二)  31-44
    2.2.3 研究通过中枢注射 5-aminoimidazole-4-carboxamide 1-β-D-ribofuranoside（AICAR）激活下丘脑 AMPK 信号通路对 LPS 导致的厌食的调节（试验三）  44-48
    2.2.4 研究通过中枢注射 Rapamycin 阻断下丘脑 mTOR 信号通路对 LPS 导致的厌食的调节（试验四）  48-49
  2.3 数据分析  49-50
3 结果分析  50-63
  3.1 腹腔注射 LPS 对动物的采食量、体重的影响  50-51
    3.1.1 腹腔注射 LPS 对采食量的影响  50
    3.1.2 腹腔注射 LPS 对体重的影响  50-51
  3.2 LPS 厌食模型中，激活 NF-кB 信号通路对食欲调节机制的影响  51-54
    3.2.1 LPS 刺激对炎症因子及 NF-кB 信号通路的影响  51-53
    3.2.2 LPS 刺激对食欲基因及 FoxO1 的影响  53-54
  3.3 AMPK 信号通路在 LPS 诱导厌食中的作用  54-58
    3.3.1 LPS 处理抑制 AMPK 的蛋白表达  54-55
    3.3.2 中枢注射 AMPK 激活剂 5-aminoimidazole-4-carboxamide 1-β-D-ribofuranoside（AICAR）对 LPS 诱导厌食的影响  55-58
  3.4 mTOR 通路在 LPS 诱导厌食中的作用  58-63
    3.4.1 LPS 处理促进 mTOR 通路的激活  58
    3.4.2 中枢注射 mTOR 抑制剂 Rapamycin，对 LPS 诱导厌食的作用  58-63
4 讨论  63-68
  4.1 腹腔注射 LPS 降低小鼠采食量并上调炎症细胞因子 mRNA 表达及 NF-кB 蛋白的磷酸化水平  63-64
  4.2 腹腔注射 LPS 改变食欲调控基因的 mRNA 表达水平且上调 FoxO1 蛋白的磷酸化水平  64-65
  4.3 AMPK 信号通路在 LPS 诱导小鼠厌食中的作用  65-66
    4.3.1 腹腔注射 LPS 对小鼠下丘脑 AMPK 的影响  65-66
    4.3.2 中枢注射 AICAR 对 LPS 导致的厌食小鼠的采食量的影响  66
  4.4 下丘脑 mTOR 信号通路在 LPS 导致的动物厌食中的作用  66-68
    4.4.1 腹腔注射 LPS 对小鼠下丘脑 mTOR 的影响  66
    4.4.2 中枢注射 Rapamycin 对 LPS 导致的厌食小鼠的采食量及食欲调节基因的表达量的影响  66-67
    4.4.3 中枢注射 Rapamycin 对 FoxO1 磷酸化水平的影响  67
    4.4.4 中枢注射 Rapamycin 对细胞因子基因表达量的影响  67
    4.4.5 中枢注射 Rapamycin 对 NF-кB 磷酸化水平的影响  67-68
5 总体结论与研究进展  68-70
  5.1 结论  68-69
  5.2 课题创新与研究展望  69-70
    5.2.1 课题创新  69
    5.2.2 研究展望  69-70
参考文献  70-82
致谢  82

下丘脑AMPK及mTOR通路在LPS诱导厌食中的作用

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