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维生素E对绵羊α-TTP表达的影响及其作用机制

作　者: 刘昆
导　师: 罗海玲
学　校: 中国农业大学
专　业: 动物营养与饲料科学
关键词: α-生育酚转移蛋白维生素E 基因克隆单克隆抗体绵羊
分类号: S826
类　型: 博士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

α-生育酚转移蛋白(α-tocopherol transfer protein, α-TTP)能够特异性结合并转运α-生育酚,是调控体内维生素E含量的重要因子。然而,维生素E对α-TTP表达的影响及其作用机制迄今仍未完全清楚。此外,目前α-TTP的相关研究主要集中于人类和鼠,在绵羊上尚没有相关报道。本研究以绵羊为试验对象,全面系统地分析了维生素E对绵羊α-TTP表达的影响及其可能的作用机制。试验一：克隆了绵羊α-TTP cDNA的全长基因,并对其基因序列进行了生物信息学分析。试验选用敖汉细毛羊公羊,通过cDNA末端快速扩增法克隆绵羊α-TTP cDNA全长基因,随后对其序列进行生物信息学分析。试验结果显示：绵羊α-TTP cDNA全长基因序列共1098bp,包含23bp的5’-非翻译区、226bp的3’-非翻译区以及849bp的开放阅读框,共编码282个氨基酸；绵羊α-TTP蛋白分子量约为32.01kD,具有1个Secl4p样脂质结合结构域,且蛋白不具备跨膜功能；绵羊α-TTP基因和相应的氨基酸序列和其它哺乳动物的同源性都比较高,但与非哺乳动物的同源性较低。试验二：通过在日粮中添加不同水平的维生素E,研究维生素E对绵羊α-TTP表达的影响。选取35只断奶后20-30天的滩羊公羔,随机分为五组。日粮中维生素E水平分别为0(E0)、20(E20)、100(E100)、200(E200)、2000(E2000)IU·羊-1·天-1,试验期为四个月。试验结果显示：日粮中添加高水平维生素E(E2000)可显著(P<0.05)提高血浆中维生素E的含量；同对照组相比,E200和E2000组显著(P<0.05)提高了肝脏中维生素E的含量,并可显著(P<0.05)提高滩羊肝脏中α-TTP蛋白的含量；同时,日粮中不同水平维生素E对滩羊肝脏中α-TTP基因的转录水平无显著影响。这表明日粮中添加高水平维生素E可显著提高滩羊血浆、肝脏中维生素E的含量以及肝脏中α-TTP蛋白的含量,但是对肝脏中α-TTP基因的转录水平无显著影响。试验三：通过人工合成多肽抗原结合淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体技术制备绵羊α-TTP的单克隆抗体,并对抗体的特异性进行检测。随后,利用免疫组织化学技术对绵羊α-TTP在肝脏细胞中的定位进行观察,并检测日粮中添加不同水平维生素E后绵羊α-TTP在肝脏中的细胞学定位与分布的变化情况。试验结果表明：成功得到了绵羊α-TTP的单克隆抗体,该抗体可以特异性地结合绵羊α-TTP;绵羊α-TTP主要定位于肝脏细胞胞质,且不同水平维生素E对绵羊α-TTP的细胞学定位、分布及表达水平均无显著影响。试验四：为研究维生素E调控α-TTP基因表达的作用机制,首先对日粮中添加不同水平维生素E的绵羊肝脏组织进行基因表达谱分析,通过对差异表达基因进行GO注释和Pathway分析后筛选出绵羊肝脏中同维生素E相关的基因。另一方面,构建人α-TTP真核表达载体并在HepG2细胞中进行表达,然后利用基因表达谱芯片分析技术筛选α-TTP的相关基因。在此基础上,对维生素E及α-TTP相关基因的生物学功能进行综合分析,阐释维生素E影响α-TTP基因表达的可能作用机制。试验结果表明：共筛选出绵羊肝脏中同维生素E相关的基因探针547个;另外,同对照组相比,在HepG2细胞中表达α-TTP后引发表达水平改变的基因探针数为323个。对相关因子分析后推测：维生素E可能通过调节机体氧化水平,调控蛋白激酶C信号途径中相关基因的表达,影响转录因子活性,直接调控同其自身转运相关的因子,影响同细胞粘附、细胞炎症和细胞凋亡等相关基因的表达以及调控转位基因的表达等机制来影响α-TTP基因的表达。试验五：通过免疫共沉淀联合质谱分析技术来分离和鉴定α-TTP的互作蛋白,以研究绵羊α-TTP的互作蛋白并探讨维生素E调控α-TTP蛋白表达的可能作用机制。试验结果表明：共筛选到10个可能与α-TTP相互作用的蛋白,这些蛋白主要为同转运、能量代谢、基因表达调控和应激相关的蛋白。然而,在动物体内它们是否与α-TTP存在相互作用还有待验证。对绵羊α-TTP互作蛋白的功能进行分析后推测：维生素E可能通过配体效应、调控机体氧化应激水平以及改变转位因子构象等机制来影响α-TTP蛋白的表达。综上所述,本论文全面系统地研究了维生素E对绵羊α-TTP表达的影响及其作用机制,这些结果将有助于对绵羊α-TTP功能及维生素E转运调控机制的理解。

全文目录

摘要  7-9
Abstract  9-11
缩写词表  11-15
第一章文献综述  15-35
  1 维生素E的结构与功能  15-25
  2 维生素E吸收、转运及代谢途径的研究进展  25-30
  3 α-生育酚转移蛋白及其功能的研究  30-32
  4 维生素E对α-生育酚转移蛋白表达影响的研究进展  32-33
  5 研究目的和研究内容  33-35
第二章试验研究  35-90
  试验一绵羊α-TTP cDNA全长基因的克隆及序列分析  35-46
    摘要  35
    1 前言  35-36
    2 材料和方法  36-43
    3 结果与讨论  43-45
    4 小结  45-46
  试验二日粮不同水平维生素E对绵羊α-TTP表达的影响  46-59
    摘要  46
    1 前言  46
    2 材料和方法  46-54
    3 结果与讨论  54-58
    4 小结  58-59
  试验三绵羊α-TTP单克隆抗体的制备与鉴定  59-68
    摘要  59
    1 前言  59-60
    2 材料和方法  60-63
    3 结果与讨论  63-67
    4 小结  67-68
  试验四维生素E及α-TTP互作基因的筛选  68-85
    摘要  68
    1 前言  68-69
    2 材料和方法  69-77
    3 结果与讨论  77-84
    4 小结  84-85
  试验五绵羊α-TTP互作蛋白的筛选  85-90
    摘要  85
    1 前言  85
    2 材料和方法  85-87
    3 结果与讨论  87-89
    4 小结  89-90
第三章结论和建议  90-91
  1 本研究的主要结论  90
  2 建议  90
  3 本研究主要创新点  90-91
参考文献  91-105
致谢  105-107
个人简介  107-108

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