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苜蓿皂苷对大鼠胆固醇代谢的影响及其调控机理

作　者: 袁德地
导　师: 史莹华
学　校: 河南农业大学
专　业: 动物营养与饲料科学
关键词: 苜蓿皂苷胆固醇 mRNA表达调控机理
分类号: S865.12
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

为了研究苜蓿皂苷对大鼠胆固醇代谢的影响，并初步探讨其分子机理。本试验以SD大鼠、BRL肝细胞、ANA-1巨噬细胞为研究对象，从个体水平上研究了苜蓿皂苷对胆固醇代谢的影响、从细胞和分子水平上研究了苜蓿皂苷降低胆固醇的机理，具体情况如下：试验一：苜蓿皂苷对大鼠胆固醇代谢的影响。取雄性健康SD大鼠32只，随机分为4组，分别为：正常对照组、苜蓿皂苷组、高脂模型组和高脂皂苷组，每组8只。前四周为高脂模型建立期，后四周为灌胃期，正常对照组和苜蓿皂苷组饲喂基础饲粮，其余2组饲喂高脂饲粮，苜蓿皂苷组和高脂皂苷组从第5周开始灌胃240mg/kg苜蓿皂苷，灌胃四周。测定试验大鼠体重、肝脏系数、血脂水平、粪便和肝脏中的胆固醇、胆汁酸含量。结果表明：（1）苜蓿皂苷显著降低高脂大鼠体重、肝脏系数；降低血清中总胆固醇含量，加速胆固醇向肝脏的聚集；增加粪便中胆固醇和胆汁酸的排出。（2）苜蓿皂苷显著增加正常血脂水平大鼠粪便中胆固醇的含量，但对体重、肝脏系数等影响不大。提示苜蓿皂苷能够调节大鼠体内胆固醇的分布，加速机体内胆固醇的排泄，具有良好的降血脂效应。试验二：苜蓿皂苷调控大鼠胆固醇代谢的分子机理研究。为了探讨苜蓿皂苷降低胆固醇的分子机理，本试验测定了SD大鼠胆固醇代谢、转运和分泌代谢过程中一系列基因mRNA表达量的变化（试验动物、分组、试验期等同试验一）；为了排除环境、动物机体代偿性调节等因素的影响，采用细胞培养的方法测定了BRL大鼠肝细胞中一系列基因mRNA表达量的变化。同时，为了研究苜蓿皂苷对胆固醇逆向转运的影响，构建了ANA-1小鼠巨噬细胞荷脂细胞模型，并测定了ABCA1、SR-B1mRNA表达量的变化。结果表明：（1）苜蓿皂苷显著升高正常大鼠肝脏LDLR、ABCG5/ABCG8、SR-B1mRNA表达量，加速大鼠体内胆固醇的转运与分泌。（2）苜蓿皂苷显著提高高脂大鼠肝脏LDLR、ABCA1、ABCG5/ABCG8、CYP7A1mRNA表达量，加速体内胆固醇向肝脏的转移、加速中性胆固醇的分泌、加速胆固醇向胆汁酸的转变，从而加速动物体内胆固醇的排泄。（3）正常BRL大鼠肝细胞LDLR、ABCA1、ABCG5/ABCG8mRNA表达量上升，CYP7A1mRNA表达量也上升，其结果与正常大鼠动物实验结果相近，而苜蓿皂苷对BRL大鼠脂变肝细胞各基因的影响不大，与高脂大鼠动物实验结果有所不同。（4）苜蓿皂苷对ANA-1小鼠巨噬细胞ABCA1、SR-B1mRNA表达量影响不大。提示：（1）苜蓿皂苷降低动物体内胆固醇的含量可能与增加LDLRmRNA表达量加速胆固醇向肝脏的转运、增加ABCG5/ABCG8mRNA表达量加速中性胆固醇的分泌、增加CYP7A1mRNA表达量加速胆固醇向胆汁酸的转变，从而加速动物机体内胆固醇的排泄有关。（2）苜蓿皂苷对高脂大鼠LDLR、CYP7A1等基因表达影响显著，而对脂变BRL肝细胞影响不大，说明苜蓿皂苷对高脂大鼠的影响是间接的，可能是代偿性的，也可能是通过激素等其他因素发挥作用，具体原因需要进一步研究。（3）苜蓿皂苷对巨噬细胞胆固醇逆向转运影响不大，主要是影响肝细胞中胆固醇的逆向转运。

全文目录

致谢  4-8
摘要  8-9
1 文献综述  9-18
  1.1 苜蓿皂苷的特征  9-11
    1.1.1 苜蓿皂苷定义  9
    1.1.2 分布和含量  9
    1.1.3 苜蓿皂苷的结构分类  9-10
    1.1.4 苜蓿皂苷的理化性质及鉴定  10
    1.1.5 苜蓿皂苷的分离提取  10
    1.1.6 苜蓿皂苷的定量分析  10-11
  1.2 苜蓿皂苷的主要生物学功能  11-12
    1.2.1 对动物生产性能的影响  11
    1.2.2 降低机体胆固醇作用  11
    1.2.3 抗氧化、促免疫作用  11-12
    1.2.4 抗菌消炎作用  12
    1.2.5 其他方面作用  12
  1.3 苜蓿皂苷降低胆固醇的应用  12-14
    1.3.1 苜蓿皂苷降低猪胆固醇的作用  12-13
    1.3.2 苜蓿皂苷降低鸡、鸡蛋中胆固醇的含量  13
    1.3.3 苜蓿皂苷降低反刍动物胆固醇的作用  13-14
    1.3.4 苜蓿皂苷降低其它单胃动物胆固醇的作用  14
  1.4 苜蓿皂苷降低机体胆固醇含量的机理研究  14-17
    1.4.1 抑制胆固醇吸收及促进胆固醇排泄  14-15
    1.4.2 抑制胆固醇合成  15
    1.4.3 促进肝细胞 LDLR 的表达  15-16
    1.4.4 抑制脂酰辅酶 A-胆固醇酰基转移酶活性  16
    1.4.5 影响胆固醇的逆转运  16
    1.4.6 促进非受体途径胆固醇代谢  16-17
  1.5 展望  17-18
2 引言  18-19
3 试验一苜蓿皂苷对大鼠胆固醇代谢的影响  19-26
  3.1 材料与方法  19-21
    3.1.1 试验材料  19
    3.1.2 主要试剂和仪器  19
    3.1.3 试验动物与分组  19-20
    3.1.4 样本的采集与制备  20
    3.1.5 指标测定与方法  20-21
      3.1.5.1 体重和肝脏系数的测定  20
      3.1.5.2 血清学相关指标的测定  20
      3.1.5.3 肝脏、粪便中总胆固醇和总胆汁酸的测定：  20-21
    3.1.6 统计分析  21
  3.2 实验结果  21-24
    3.2.1 高脂模型建立期大鼠体重变化情况  21
    3.2.2 建模末期大鼠血清学指标变化情况  21-22
    3.2.3 苜蓿皂苷对大鼠体重和肝脏系数的影响  22
    3.2.4 苜蓿皂苷对大鼠血清指标的影响  22-23
    3.2.5 苜蓿皂苷对大鼠肝脏、粪便中胆固醇含量的影响  23
    3.2.6 苜蓿皂苷对大鼠肝脏、粪便中胆汁酸含量的影响  23-24
  3.3 讨论  24-25
    3.3.1 苜蓿皂苷对高脂大鼠胆固醇代谢的影响  24
    3.3.2 苜蓿皂苷对正常大鼠胆固醇代谢的影响  24-25
  3.4 结论  25-26
4 试验二苜蓿皂苷调控大鼠胆固醇代谢的分子机理研究  26-45
  4.1 材料与方法  26-30
    4.1.0 实验材料  26
    4.1.1 主要试剂和仪器  26-28
    4.1.2 动物实验  28
    4.1.3 细胞培养  28-30
      4.1.3.1 细胞的无菌培养  28
      4.1.3.2 细胞计数  28-29
      4.1.3.3 BRL 大鼠肝细胞的培养  29
      4.1.3.4 ANA-1 小鼠巨噬细胞的培养  29-30
  4.2 指标测定与方法  30-37
    4.2.1 MTT 法测定苜蓿皂苷对 BRL、ANA-1 细胞活性的影响  30-31
      4.2.1.1 MTT 溶液的配制  30
      4.2.1.2 细胞活性的测定方法  30-31
    4.2.2 mRNA 相对表达量测定  31-37
      4.2.2.1 大鼠肝脏、细胞总 RNA 提取  31-32
      4.2.2.2 RNA 浓度的测定  32
      4.2.2.3 总 RNA 的质量检测  32
      4.2.2.4 RNA 反转录过程  32-33
      4.2.2.5 引物设计与合成  33-36
      4.2.2.6 荧光定量 PCR  36
      4.2.2.7 统计分析  36-37
  4.3 试验结果  37-41
    4.3.1 苜蓿皂苷对 BRL、ANA-1 细胞活性的影响  37
    4.3.2 苜蓿皂苷对胆固醇转运和分泌的影响  37-38
      4.3.2.1 苜蓿皂苷对大鼠肝细胞 LDLR、ABCG5/ABCG8 的影响  37-38
      4.3.2.2 苜蓿皂苷对大鼠 BRL 肝细胞 LDLR、ABCG5/ABCG8 的影响  38
    4.3.3 苜蓿皂苷对胆固醇逆向转运的影响  38-40
      4.3.3.1 苜蓿皂苷对大鼠 ABCA1、SR-B1 的影响  38-39
      4.3.3.2 苜蓿皂苷对大鼠 BRL 肝细胞 ABCA1、SR-B1 的影响  39
      4.3.3.3 苜蓿皂苷对小鼠巨噬细胞 Ana-1 ABCA1、SR-B1 的影响  39-40
    4.3.4 苜蓿皂苷对胆固醇转化的影响  40-41
      4.3.4.1 苜蓿皂苷对大鼠肝脏 CYP7A1、CYP27A1 的影响  40
      4.3.4.2 苜蓿皂苷对大鼠 BRL 肝细胞 CYP7A1 的影响  40-41
  4.4 讨论  41-44
    4.4.1 苜蓿皂苷对 BRL、ANA-1 细胞活性的影响  41
    4.4.2 苜蓿皂苷对胆固醇转运的影响  41-42
    4.4.3 苜蓿皂苷对胆固醇逆向转运的影响  42-43
    4.4.4 苜蓿皂苷对胆固醇清除的影响  43-44
  4.5 小结  44-45
5 结论与展望  45-47
  5.1 结论  45
  5.2 展望  45-47
参考文献  47-54
Abstract  54-55

苜蓿皂苷对大鼠胆固醇代谢的影响及其调控机理

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