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葡萄不同生育期总RNA提取及SSH建立

作　者: 申鹏
导　师: 陈佰鸿
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 果树学
关键词: 葡萄 RNA提取多糖多酚 SSH
分类号: S663.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

通过抑制性消减杂交（SSH）技术可以筛选出具有差异表达的抗寒基因，并进一步克隆相关抗寒基因，已成为目前科研工作者在如何提高植物抗寒性方面研究的切入点。本试验选取山葡萄和红地球葡萄两种具有抗寒性差异的葡萄品种作为试验材料，对其在总RNA提取过程中去除多糖多酚类物质干扰进行试验条件优化，从而提取出质量较高的山葡萄和红地球葡萄枝条韧皮部总RNA，之后利用SSH技术对处于休眠过程中的山葡萄和红地球葡萄进行正向和反向的SSH建立，为找到相关抗寒基因以及对后续试验的进行提供保证。本论文试验主要内容和结果如下：1.生长期的山葡萄和红地球葡萄枝条韧皮部RNA在提取过程中对提取液浓度（2%和3%）、KAc酸碱度（pH5.8、5.4、5.2、4.8）、沉淀剂的选择（LiCl、NaAc和无水乙醇、异丙醇）及用量（0.5V、0.8V、1.0V和1.5V）进行试验优化，试验结果表明，3%CTAB提取液+10%PVP+1/4V5M KAc（pH5.8）和0.4V2-丁氧乙醇+1.5V异丙醇沉淀RNA，提取效果最好。2.在秋季休眠过程中的山葡萄和红地球葡萄多糖多酚类干扰物质积累较初期明显增多，其枝条韧皮部RNA的提取用生长期的方法很难提取，所以对生长期方法中的裂解时间（15min、20min、30min、40min）、氯仿抽提时间（10min、15min）、以及1.5V异丙醇沉淀后离心条件三方面进行试验条件优化，筛选出了水浴30min、氯仿抽提离心15min和异丙醇沉淀RNA后在4℃下12000rpm离心10min的方法，提取出的RNA质量高能达到进行SSH分析的要求。3.由于试管苗在生理生化方面比大田苗简单，所含的多糖多酚类干扰物质也较少，试验结果表明1/10V3M NaAc（pH5.2）和2V无水乙醇可以有效将干扰物质去除，提取出质量较好的总RNA。4.对休眠过程中山葡萄和红地球葡萄进行SSH分析，将韧皮部总RNA分别反转录合成双链cDNA、然后双链cDNA经过RsaⅠ酶切、接头连接，两次杂交后进行PCR扩增，试验对PCR扩增条件中的底物浓度、循环次数和退火温度进行优化设计，选择出第一次PCR扩增体系用11l RNase Free H2O+12lDreamTaqTMGreen PCR Master Mix+5l模板cDNA+1l PCR Primer1，反应程序为94℃25sec，（94℃10sec、58℃30sec、72℃90sec）35cycles。第二次PCR反应体系12l DreamTaqTMGreen PCR Master Mix+11l模板（第一次扩增产物）+1l Nested PCR primer1+1l Nested PCR primer2R，反应程序为（94℃10sec、60℃30sec、72℃90s）12cycles。经过两次PCR扩增后效果最好。5.试验选取休眠过程中的山葡萄和红地球葡萄总RNA，通过抑制性消减杂交技术，然后经过蓝白斑筛选和菌液PCR进行阳性克隆筛选，得到插入片段基本在250-1000bp范围内，符合建库要求，初步对休眠过程中山葡萄和红地球葡萄进行了正向和反向SSH的建立。

全文目录

摘要  2-4
Summary  4-6
缩略词  6-10
第一章文献综述  10-22
  1 植物材料 RNA 提取方法研究进展  10-14
    1.1 富含多糖、多酚类物质的植物材料的 RNA 提取  11-12
      1.1.1 多酚类物质  11-12
      1.1.2 多糖类物质  12
    1.2 蛋白污染及次生代谢产物的污染  12-13
    1.3 RNA 提取过程中常见问题及解决办法  13-14
      1.3.1 外源性 RNase 的污染  13-14
        1.3.1.1 试验器材的污染  13
        1.3.1.2 试验人员的污染  13
        1.3.1.3 试验试剂的污染  13-14
      1.3.2 内源性 RNase 的污染  14
    1.4 RNA 的纯化  14
  2 抑制性消减杂交技术  14-21
    2.1 抑制性消减杂交技术的原理  14-15
    2.2 抑制性消减杂交的操作流程  15
    2.3 抑制性消减杂交技术的优点与不足  15-16
      2.3.1 抑制性消减杂交技术的优点  15-16
      2.3.2 抑制性消减杂交技术的不足之处  16
    2.4 抑制性消减杂交技术在植物中的应用  16-21
      2.4.1 在植物生长发育过程中基因表达变化研究中的应用  16-17
      2.4.2 在植物受到非生物胁迫研究中的应用  17-19
      2.4.3 在植物受到生物胁迫研究中的应用  19-21
  3 本试验研究技术路线  21-22
第二章葡萄总 RNA 的提取  22-33
  1 试验材料与方法  22-25
    1.1 试验材料  22
      1.1.1 试验材料的确定  22
      1.1.2 主要试剂  22
      1.1.3 器材处理  22
    1.2 试验方法  22-25
      1.2.1 山葡萄和红地球葡萄生长期枝条韧皮部总 RNA 提取方法  22-23
      1.2.2 山葡萄和红地球葡萄休眠过程中枝条韧皮部提取方法  23-24
      1.2.3 葡萄试管苗 RNA 的提取方法  24
      1.2.4 山葡萄和红地球葡萄叶片和果皮总 RNA 的提取  24
      1.2.5 总 RNA 的纯化  24-25
      1.2.6 RNA 电泳检测  25
  2 结果与分析  25-33
    2.1 山葡萄和红地球葡萄生长期枝条韧皮部 RNA 提取结果与分析  25-29
      2.1.1 不同浓度的 CTAB 提取缓冲液对 RNA 提取效果的影响  25-26
      2.1.2 不同 pH 条件下 5M KAc 对去除多糖的效果  26-27
      2.1.3 选用不同沉淀剂对 RNA 提取的影响  27
      2.1.4 异丙醇沉淀 RNA 用量对 RNA 提取的影响  27-28
      2.1.5 山葡萄和红地球葡萄生长期 RNA 提取方法的确定  28-29
    2.2 红地球和山葡萄休眠过程中枝条韧皮部 RNA 提取结果与分析  29-30
      2.2.1 不同裂解时间对 RNA 提取的影响  29
      2.2.2 不同离心时间对 RNA 提取的影响  29-30
      2.2.3 山葡萄和红地球葡萄休眠过程中 RNA 提取方法的确定  30
    2.2 葡萄试管苗叶片和茎段总 RNA 提取结果  30-31
    2.3 山葡萄和红地球葡萄叶片及果皮 RNA 提取结果  31
    2.4 DNaseⅠ纯化处理总 RNA  31-33
第三章 SSH 建立  33-44
  1 试验材料  33
    1.1 试验材料  33
    1.2 主要试剂  33
  2 抑制性消减杂交  33-39
    2.1 cDNA 的合成  33-35
      2.1.1 第一链 cDNA 的合成  33-34
      2.1.2 第二链 cDNA 的合成  34-35
    2.2 RsaⅠ酶切  35-36
    2.3 接头连接  36-37
    2.4 杂交  37-38
      2.4.1 第一次消减杂交  37
      2.4.2 第二次消减杂交  37-38
    2.5 PCR 扩增  38-39
  3 SSH 建立  39-41
    3.1 PCR 产物的连接  39-40
    3.2 大肠杆菌感受态细胞的制备-CaCl2法  40
    3.3 连接产物的转化  40-41
    3.4 蓝白斑筛选  41
  4 结果与分析  41-44
    4.1 cDNA 的合成及 RsaⅠ酶切效果检测分析结果  41
    4.2 消减杂交 PCR（巢式 PCR）结果分析  41-42
    4.3 PCR 产物连接结果  42
    4.4 转化后的菌液 PCR 电泳结果  42-44
第四章讨论  44-47
第五章结论  47-48
参考文献  48-56
附录主要试剂及溶液(缓冲液)配制  56-57
致谢  57-58
导师简介  58-59
作者简介  59-60

葡萄不同生育期总RNA提取及SSH建立

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