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平菇几丁质酶基因PoChil的克隆与分析

作　者: 段庆虎
导　师: 申进文
学　校: 河南农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 真菌食用菌平菇几丁质酶基因原核表达过量表达反义表达
分类号: S646.14
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

几丁质酶（chitinase）通过参与真菌细胞壁的合成与降解，在真菌形态发生和生长发育过程中起关键作用。尚没有发现有关平菇几丁质酶基因的研究和报道。本研究克隆了平菇几丁质酶基因PoChi1，构建了原核表达载体，并在E.coli BL21（DE3）中实现了原核表达；通过半定量RT-PCR的方法研究了PoChi1的表达模式；构建了过量表达载体和反义表达载体，通过农杆菌介导转化平菇菌丝块，利用潮霉素抗性筛选及PCR检测得到了阳性转化子；分析了转化子与出发菌株的差异。初步研究了PoChi1对平菇形态发生和生长发育的调控作用，研究的主要结论如下：1.提取平菇菌丝总RNA，使用反转录PCR方法，首次克隆得到了平菇几丁质酶基因PoChi1。生物信息学分析表明，编码序列长1,188bp，翻译395个氨基酸，包含信号肽、三个高度保守的区域和短的C端区域。POCHI1二级结构和三级结构的预测表明其具有18家族的几丁质酶相似的（βα）8的圆桶形结构，建树分析表明POCHI1可归属于Ⅲ类几丁质酶。2.构建了原核表达载体，在E.coli BL21（DE3）实现了原核表达，SDS-PAGE分析表明PoChi1编码蛋白的相对分子量约为29kDa，测定的粗酶液酶活为2.172U·mL-1。半定量RT-PCR分析该基因在平菇不同生长阶段表达模式表明，PoChi1在平菇成熟期表达水平最高，该基因在平菇子实体生长发育过程中可能起了一定作用。3.利用平菇内源gpd启动子，构建了PoChi1过量表达载体pBHg-gpt和反义表达载体pBHg-gfpt。4.通过农杆菌介导的方法将pBHg、pBHg-gpt和pBHg-gfpt转入到平菇新831菌株中。在含有100μg·mL-1潮霉素的PDA培养基上初步筛选分别得到3、4、6株拟转化子，经PCR鉴定后得到3、2、1株阳性转化子。对转化子和出发菌株进行培养观察。结果发现，过量表达PoChi1的平菇菌株pg比出发菌株菌丝长势好；沉默表达PoChi1的平菇菌株pg比出发菌株菌丝长势差。推测几丁质酶基因可能影响平菇菌丝生长发育。综上所述，本研究从平菇中首次克隆到了几丁质酶基因PoChi1，生物信息学分析显示属于Ⅲ类几丁质酶基因。在大肠杆菌BL21（DE3）中实现了几丁质酶基因的表达并检测到几丁质酶活性。PoChi1在平菇不同生长阶段的表达模式和该基因在平菇转化子中的过量和沉默表达结果表明，平菇几丁质酶基因可能参与了子实体生长发育和菌丝生长发育过程。对该基因功能的进一步研究，将可能揭示几丁质酶基因与平菇形态发生、生长发育之间的关系。

全文目录

致谢  4-10
摘要  10-11
第一章文献综述  11-19
  1.1 几丁质酶  11-14
    1.1.1 几丁质酶的分类  11
    1.1.2 几丁质酶的结构  11
    1.1.3 几丁质酶的催化机制  11-12
    1.1.4 几丁质酶活性测定方法  12
    1.1.5 几丁质酶的作用  12-13
    1.1.6 几丁质酶基因克隆  13
    1.1.7 几丁质酶基因表达调控  13
    1.1.8 植物几丁质酶的研究  13-14
    1.1.9 动物几丁质酶的研究  14
    1.1.10 真菌几丁质酶的研究  14
  1.2 丝状真菌基因功能的研究方法  14-16
  1.3 食用菌转化方法研究  16-18
    1.3.1 PEG 介导转化法  16
    1.3.2 限制性内切酶介导整合法（REMI）  16
    1.3.3 基因枪法  16-17
    1.3.4 电击法  17
    1.3.5 农杆菌介导转化  17-18
  1.4 平菇遗传转化的研究  18-19
第二章平菇几丁质酶基因的克隆与生物信息学分析  19-32
  2.1 材料和方法  19-22
    2.1.1 材料  19-20
      2.1.1.1 菌种和质粒  19
      2.1.1.2 培养基的配制  19
      2.1.1.3 主要试剂  19
      2.1.1.4 仪器  19-20
    2.1.2 目的基因 PoChi1 的获取  20-21
      2.1.2.1 设计引物  20
      2.1.2.2 平菇总 RNA 提取  20
      2.1.2.3 cDNA 第一条链的合成  20
      2.1.2.4 平菇基因组 DNA 提取  20
      2.1.2.5 目的基因的 PCR 扩增  20-21
      2.1.2.6 PCR 产物回收纯化  21
      2.1.2.7 PCR 回收产物与 pMD19 simple T 载体连接  21
    2.1.3 连接产物转化感受态细胞  21-22
      2.1.3.1 感受态细胞的制备  21
      2.1.3.2 转化感受态细胞  21-22
    2.1.4 重组质粒提取及鉴定  22
    2.1.5 PoChi1 基因的测定  22
    2.1.6 平菇几丁质酶基因生物信息学分析  22
  2.2 结果与分析  22-31
    2.2.1 基因 PoChi1 的克隆与测序  22
    2.2.2 平菇几丁质酶基因生物信息学分析结果  22-31
  2.3 小结  31-32
第三章 PoChi1 的原核表达与表达模式分析  32-42
  3.1 材料与方法  32-38
    3.1.1 材料  32-33
      3.1.1.1 菌种和质粒  32
      3.1.1.2 培养基配方  32
      3.1.1.3 主要试剂  32
      3.1.1.4 仪器  32-33
    3.1.2 表达载体 pEASY-pochi1 的构建  33
      3.1.2.1 目的基因的 PCR 扩增  33
      3.1.2.2 PCR 产物回收纯化  33
      3.1.2.3 PCR 回收产物与 pEASY-E2 表达载体连接  33
      3.1.2.4 连接产物转化感受态细胞  33
    3.1.3 重组质粒的提取和鉴定  33-35
      3.1.3.1 重组质粒的提取  33
      3.1.3.2 重组质粒的鉴定  33-35
    3.1.4 表达载体 pEASY-pochi1 转化感受态细胞  35
      3.1.4.1 感受态细胞的制备  35
      3.1.4.2 转化感受态细胞  35
      3.1.4.3 重组质粒提取及鉴定  35
    3.1.5 诱导表达  35-36
    3.1.6 粗酶液几丁质酶活性的测定  36
      3.1.6.1 标准曲线的制备  36
      3.1.6.2 测定粗酶液几丁质酶活性  36
    3.1.7 平菇几丁质酶基因表达模式分析  36-38
      3.1.7.1 培养平菇新 831  36
      3.1.7.2 提取平菇总 RNA  36
      3.1.7.3 cDNA 第一条链的合成  36-37
      3.1.7.4 半定量 RT-PCR  37-38
  3.2 结果与分析  38-41
    3.2.1 原核表达载体的构建  39
    3.2.2 重组蛋白诱导表达和 SDS-PAGE 分析  39-40
    3.2.3 粗酶液几丁质酶活性测定结果  40-41
    3.2.4 平菇几丁质酶基因 PoChi1 的表达模式分析  41
  3.3 本章小结  41-42
第四章平菇 PoChi1 过量表达载体和反义表达载体的构建  42-60
  4.1 材料与方法  42-49
    4.1.1 材料  42
      4.1.1.1 菌种和质粒  42
      4.1.1.2 培养基配方  42
      4.1.1.3 主要试剂  42
      4.1.1.4 仪器  42
    4.1.2 引物的设计  42-43
    4.1.3 平菇 PoChi1 过量表达载体的构建  43-47
      4.1.3.1 平菇 gpd 启动子的克隆  43-44
      4.1.3.2 平菇 PoChi1、T35S 的克隆  44-46
      4.1.3.3 克隆载体 T-gpt 的构建  46-47
      4.1.3.4 过量表达载体 pBHg-gpt 的构建  47
    4.1.4 平菇 PoChi1 反义表达载体的构建  47-49
      4.1.4.1 平菇反 PoChi1 的克隆  47-48
      4.1.4.2 克隆载体 T-gfpt 的构建  48
      4.1.4.3 反义表达载体 pBHg-gfpt 的构建  48-49
  4.2 结果与分析  49-59
    4.2.1 平菇 PoChi1 过量表达载体的构建  49-54
    4.2.2 平菇 PoChi1 反义表达载体的构建  54-59
      4.2.2.1 反义 PoChi1 的克隆  54-56
      4.2.2.2 PoChi1 反义表达载体的构建  56-59
  4.3 本章小结  59-60
第五章转几丁质酶基因平菇菌株的筛选与分析  60-70
  5.1 材料与方法  60-63
    5.1.1 材料  60
      5.1.1.1 菌种和质粒  60
      5.1.1.2 培养基配方  60
      5.1.1.3 主要试剂  60
      5.1.1.4 仪器  60
    5.1.2 转化农杆菌 EHA105  60-61
      5.1.2.1 农杆菌感受态细胞的制备  61
      5.1.2.2 pBHg-gpt 和 pBHg-gfpt 转化农杆菌 EHA105  61
    5.1.3 平菇潮霉素筛选浓度的确定  61
    5.1.4 农杆菌介导转化平菇  61
    5.1.5 筛选与 PCR 分析  61-63
      5.1.5.1 设计引物  61
      5.1.5.2 潮霉素抗性筛选与 PCR 分析  61-63
    5.1.6 转化子和出发菌株培养  63
  5.2 结果与分析  63-69
    5.2.1 转化农杆菌检测  63-64
    5.2.2 潮霉素筛选浓度的确定  64
    5.2.3 转几丁质酶基因平菇菌株的筛选及鉴定  64-68
    5.2.4 转化子和出发菌株菌丝生长情况  68-69
  5.3 小结  69-70
第六章讨论  70-71
参考文献  71-84
英文摘要  84-85

平菇几丁质酶基因PoChil的克隆与分析

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