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成熟期烟草根际效应研究

作　者: 李小林
导　师: 张小平
学　校: 四川农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 烟草 土壤 根际效应 微生物学特性 可培养微生物 免培养微生物 群落结构 多样性 DGGE LH-PCR
分类号: S572
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


为了了解成熟期烟草的根际效应,本文以盐边县代表性烟草种植区域的成熟期烟草根际及非根际土壤为研究对象,测定了主要土壤理化性质,应用化学分析方法研究了微生物生物量碳、土壤酶活性和真菌生物量,利用平板计数法分析了可培养微生物数量,利用16S rDNA限制性片段长度多态性(16S rDNA-RFLP)分子标记法分析了可培养细菌、放线菌、真菌及固氮细菌的群落结构和多样性,结合长度多态片段PCR(LH-PCR)和变性凝胶梯度电泳(DGGE)技术分析了免培养细菌群落结构及多样性,利用DGGE分析了免培养放线菌、真菌(包括18S基因和ITS基因)、nifH基因、硝化细菌及丛枝菌根真菌群落结构和多样性,结合典型对应分析和多元回归树分析研究了土壤环境因子对微生物学特性的影响,进而探讨了成熟期烟草的根际效应。主要结果如下：(1)土壤理化性质分析结果表明,烟草根际在一定程度上有酸化土壤和增加土壤有机质含量的趋势。由于菌根真菌和根际酸化作用的原因,烟草根际总磷、速效磷及速效钾含量显著高于非根际土壤。由于植物根际强烈吸收养分物质等原因,根际土壤中总氮的含量明显低于非根际土壤。(2)对烟草土壤微生物生物量碳、土壤酶活性、真菌生物量、可培养微生物数量、可培养及免培养微生物群落结构和多样性的分析结果表明,由于烟草自毒物质的积累,虽然典型的根际效应在某些样点某些特性中能观察到,但系统的根际效应在成熟期烟草中没有体现。(3)成熟期烟草土壤可培养微生物中细菌遗传多样性最为丰富,其次为可培养真菌和放线菌,固氮细菌最弱。在DGGE分析中,免培养微生物中细菌遗传多样性最丰富,其次依次为放线菌、真菌ITS基因、nifH基因、丛枝菌根真菌、硝化细菌,最弱的为真菌18S基因。(4)在对比实验中,结合LH-PCR和DGGE分析细菌群落结构结果表明,DGGE分析的细菌多样性指数显著高于LH-PCR分析结果,同时所获取的微生物群落结构信息更为丰富,但LH-PCR技术相对于DGGE技术更为简便、快速、稳定和低耗。结合真菌18S基因和ITS基因对比分析结果表明,真菌ITS基因扩增的真菌遗传多样性指数显著高于18S基因。(5)成熟期烟草根际和非根际可培养微生物优势种群差异显著。其中,根际可培养优势细菌为金黄杆菌属(Chryseobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、肠杆菌属(Enterobacter)和不动杆菌属(Acinetobacter)、优势放线菌均为链霉菌属(Streptomyces);优势真菌为根霉属(Rhizopus)、犁头霉属(Absidia)、赤霉属(Gibberella)、镰刀菌属(Fusarium)、青霉属(Penicillium)、曲霉属(Aspergillus)等；可培养固氮菌主要属于根瘤菌属(Rhizobium)和杆菌属(Arthrobacter)及土壤杆菌属(Agrobacterium)。而非根际可培养优势细菌为节杆菌属(Arthrobacter)、短芽胞杆菌属(Brevibacillus)和不动杆菌属(Acinetobacter);优势放线菌均为链霉菌属(Streptomyces);优势真菌为镰刀菌属(Fusarium)、正青霉属(Eupenicillium)、毛壳菌属(Chaetomium)、拟青霉属(Paecilomyces)及下皮黑孔菌属(Cerrena)等；优势固氮细菌为肠杆菌属(Enterobacter)和杆菌属(Arthrobacter)。(6)总体上看,相对于烟草根际土壤,非根际土壤免培养微生物表现出更强的特异性。其中,烟草成熟期根际特有的微生物为栓菌属(Trametes)和部分不可培养真菌；非根际特有微生物包括假诺卡氏菌(Pseudonocardia)、厄氏菌(Oerskovia)、小单孢菌(Promicromonospora)、蜡蚧菌属(Lecanicillium)、假单孢菌属(Pseudomonas)、青霉属(Penicillium)及部分不可培养真菌和子囊真菌。(7)成熟期烟草根际和非根际免培养微生物优势种群差异显著。其中,根际土壤中优势免培养细菌为Steroidobacter属、硝化螺旋菌属(Nitrospira)、根瘤菌目(Rhizobiales)和a-变形菌；优势免培养放线菌为链霉菌(Streptomyces)和暂未准确分类的免培养放线菌；优势免培养真菌为马拉色菌属(Malassezia)、球囊霉属(Glomus)、镰刀菌属(Fusarium)、角担菌科(Ceratobasidiaceae)、伞菌纲(Agaricomycetes)、散囊菌纲(Eurotiomycetes)及暂未准确确定分类系统的不可培养真菌和子囊真菌；优势nifH基因为固氮捲菌属(Azonexus)、红环菌科(Rhodocyclaceae)细菌及不可培养细菌nifH基因；优势硝化细菌为硝化螺旋菌属(Nitrospira)及暂未准确确定分类系统的不可培养细菌；优势丛枝菌根真菌球囊霉属(Glomus)和暂未准确确定分类的不可培养真菌。而成熟期非根际优势免培养细菌为Steroidobacter属、放线菌目(Actinomycetales)和Chitinophagac eae科；优势免培养放线菌为链霉菌(Streptomyces)、分支杆菌(Mycobacterium)、厄氏菌(Oerskovia)及暂未准确分类的免培养放线菌；优势免培养真菌为蜡蚧菌属(Lecanicillium)、镰刀菌属(Fusarium)、角担菌科(Ceratobasidiaceae)、伞菌纲(Agaricomycetes)和暂未准确确定分类系统的不可培养真菌及子囊真菌；优势nifH基因为固氮捲菌属(Azonexus)、红环菌科(Rhodocyclaceae)细菌及不可培养细菌nifH基因；优势硝化细菌为硝化螺旋菌属(Nitrospira)及暂未准确确定分类系统的不可培养细菌：优势丛枝菌根真菌为球囊霉属(Glomus)。(8)综合典型对应分析和多元回归树分析结果表明,总磷及速效磷对烟草土壤微生物生物量碳、土壤酶活性及真菌生物量的影响最大,速效钾及速效磷是影响可培养微生物数量最关键的环境因子,速效钾、速效磷、速效氮及总氮对免培养微生物多样性的影响显著,其中又以速效钾为最显著因素,同时土壤环境因子中总磷及速效磷对细菌多样性影响最大,速效钾对放线菌和真菌多样性影响最大,速效氮和有机质对nifH基因多样性影响最大,速效磷对硝化细菌和丛枝菌根真菌多样性影响最大。

全文目录


摘要  8-11
Abstract  11-14
第一章 前言  14-25
  1 土壤理化性质与微生物的关系  14-16
    1.1 土壤理化性质对微生物多样性的影响  14
    1.2 土壤理化性质对微生物活性的影响  14-15
    1.3 土壤理化性质对微生物量的影响  15-16
  2 土壤微生物的研究方法  16-21
    2.1 传统的微生物培养法  16
    2.2 可培养分子生物学方法  16-18
      2.2.1 扩增片段长度多态性  16-17
      2.2.2 随即扩增多态性DNA  17
      2.2.3 扩增片段长度多态性  17-18
      2.2.4 基因组简单重复序列PCR标记  18
    2.3 免培养分子生物学方法  18-21
      2.3.1 变性梯度凝胶电脉(DGGE)  18-19
      2.3.2 单链构象多态性分析(SSCP)  19-20
      2.3.3 核糖体间隔基因自动分析(ARISA)  20
      2.3.4 末端限制性片段长度多样性(T-RFLP)  20-21
      2.3.5 长度多态性片段PCR(LH-PCR)  21
  3 烟草土壤微生物研究进展  21-24
    3.1 根际及根际微生物  21-22
    3.2 烟草根际土壤采集  22
    3.3 烟草根际微生物研究进展  22-23
    3.4 烟草根际微生物数量  23
    3.5 烟草根际优势微生物种群  23-24
  4 研究目的与意义  24-25
第二章 土壤理化性质对部分微生物特性的影响  25-34
  1. 材料与方法  25-26
    1.1 样品采集  25
    1.2 土壤理化性质的分析  25-26
    1.3 土壤微生物生物量碳分析  26
    1.4 土壤真菌生物量分析  26
    1.5 土壤酶活性的测定  26
    1.6 数据处理  26
  2 结果与分析  26-31
    2.1 烟草土壤理化性质分析  26-28
    2.2 微生物学特性分析  28-29
    2.3 土壤理化性质对微生物学特性的影响  29-31
      2.3.1 典型对应分析  29-30
      2.3.2 多元回归树分析  30-31
  3. 讨论与结论  31-34
    3.1 理化特性在烟草土壤中的表现  31-32
    3.2 微生物特性对根际效应的响应  32
    3.3 理化性质对微生物特性的影响  32-33
    3.4 小结  33-34
第三章 烟草种植对可培养微生物数量、群落结构及多样性影响  34-67
  1. 材料与方法  34-38
    1.1 可培养微生物数量分析  34
    1.2 可培养细菌遗传多样性分析  34-35
      1.2.1 供试菌株DNA提取  34
      1.2.2 细菌16S rDNA PCR-RFLP指纹图谱分析  34-35
      1.2.3 代表菌株16S rDNA序列测序分析  35
    1.3 可培养放线菌遗传多样性分析  35-36
      1.3.1 供试菌株DNA的提取  35
      1.3.2 放线菌16S rDNA PCR-RFLP指纹图谱分析  35-36
      1.3.3 代表菌株16S rDNA序列测序  36
    1.4 可培养真菌遗传多样性分析  36-37
      1.4.1 供试菌株DNA的提取  36-37
      1.4.2 真菌18S rDNA PCR-RFLP指纹图谱分析  37
      1.4.3 代表菌株18S rDNA序列测序分析  37
    1.5 可培养固氮菌遗传多样性分析  37-38
      1.5.1 供试菌株DNA的提取  37
      1.5.2 固氮菌16S rDNA PCR-RFLP指纹图谱分析  37-38
      1.5.3 代表菌株16S rDNA序列测序分析  38
    1.6 数据分析和处理  38
  2 结果与分析  38-62
    2.1 土壤环境因子对微生物数量的影响  38-40
      2.1.1 可培养微生物数量分析  38-39
      2.1.2 环境因子对微生物数量的影响  39-40
    2.2 可培养细菌遗传多样性  40-46
      2.2.1 16S rDNA PCR-RFLP酶切聚类分析  40-43
      2.2.2 16S rDNA PCR-RFLP主成分分析  43-44
      2.2.3 代表菌株16S rDNA基因序列分析  44-46
    2.3 可培养放线菌遗传多样性  46-52
      2.3.1 16S rDNA RFLP酶切聚类分析  46-49
      2.3.2 16S rDNA RFLP主成分分析  49-50
      2.3.3 代表菌株16S rDNA序列分析  50-52
    2.4 可培养真菌遗传多样性  52-57
      2.4.1 可培养真菌PCR-RFLP酶切聚类分析  52-54
      2.4.2 真菌18S rDNA PCR-RFLP主成分分析  54-55
      2.4.3 代表菌株18S rDNA序列分析  55-57
    2.5 可培养固氮菌遗传多样性  57-62
      2.5.1 16S rDNA PCR-RFLP酶切聚类分析  57-60
      2.5.2 16S rDNA PCR-RFLP主成分分析  60-61
      2.5.3 代表菌株16S rDNA序列分析  61-62
  3 讨论与结论  62-67
    3.1 烟草种植对微生物数量的影响  62-63
    3.2 烟草种植对可培养细菌的影响  63-64
    3.3 烟草种植对可培养放线菌的影响  64
    3.4 烟草种植对可培养真菌的影响  64-65
    3.5 烟草种植对可培养固氮细菌的影响  65-66
    3.6 小结  66-67
第四章 烟草种植对免培养微生物群落结构及多样性的影响  67-137
  1 材料与方法  67-74
    1.1 土壤总DNA的提取与纯化  67
    1.2 运用DGGE分析土壤微生物群落结构  67-72
      1.2.1 细菌16S rDNA的扩增  67
      1.2.2 放线菌16S rDNA的扩增  67-68
      1.2.3 真菌18S rDNA的扩增  68
      1.2.4 真菌ITS rDNA的扩增  68-69
      1.2.5 AM真菌18S rDNA扩增  69-70
      1.2.6 nifH基因的扩增  70
      1.2.7 硝化细菌16S rDNA的扩增  70-71
      1.2.8 PCR产物检测  71
      1.2.9 PCR产物的变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析  71-72
      1.2.10 DGGE优势及特异条带的回收分析  72
    1.3 运用LH-PCR分析土壤细菌群落结构  72-73
      1.3.1 土壤细菌PCR扩增  72
      1.3.2 分子标准的制作  72-73
      1.3.3 毛细管电泳  73
    1.4 数据分析与处理  73-74
      1.4.1 DGGE数据分析  73-74
      1.4.2 LH-PCR数据分析  74
      1.4.3 方差及统计分析  74
  2 结果与分析  74-129
    2.1 烟草种植对免培养细菌的影响  74-87
      2.1.1 细菌DGGE图谱群落结构  74-76
      2.1.2 细菌DGGE图谱多样性  76-77
      2.1.3 细菌DGGE代表条带序列分析  77-79
      2.1.4 环境因子对DGGE细菌多样性的影响  79-81
      2.1.5 细菌LH-PCR图谱群落结构  81-83
      2.1.6 细菌LH-PCR多样性  83-84
      2.1.7 环境因子对细菌LH-PCR多样性的影响  84-85
      2.1.8 环境因子对免培养细菌多样性的影响  85-87
    2.2 烟草种植对放菌菌群落结构及多样性的影响  87-93
      2.2.1 放线菌群落结构分析  87-89
      2.2.2 放线菌DGGE图谱多样性  89
      2.2.3 放线菌DGGE代表条带序列分析  89-91
      2.2.4 环境因子对免培养放线菌多样性的影响  91-93
    2.3 烟草种植对免培养真菌群落结构与多样性的影响  93-108
      2.3.1 真菌18S基因群落结构分析  93-95
      2.2.2 真菌18S基因多样性分析  95
      2.3.3 真菌18S基因DGGE代表条带序列分析  95-98
      2.3.4 环境因子对真菌18S基因多样性的影响  98-100
      2.3.5 真菌ITS基因群落结构分析  100-102
      2.3.6 真菌ITS基因多样性分析  102
      2.3.7 真菌ITS基因DGGE代表条带序列分析  102-105
      2.3.8 环境因子对真菌ITS基因多样性的影响  105-107
      2.3.9 环境因子对免培养真菌多样性的影响  107-108
    2.4 烟草种植对nifH基因群落结构及多样性的影响  108-115
      2.4.1 nifH基因群落结构分析  108-110
      2.4.2 nifH基因多样性分析  110-111
      2.4.3 nifH基因代表条带序列分析  111-113
      2.4.4 环境因子对nifH洲基因多样性的影响  113-115
    2.5 硝化细菌多样性及环境因子对其影响  115-121
      2.5.1 硝化细菌群落结构  115-117
      2.5.2 硝化细菌多样性分析  117-118
      2.5.3 硝化细菌代表条带序列分析  118-119
      2.5.4 环境因子对硝化细菌多样性的影响  119-121
    2.6 烟草种植对丛枝菌根真菌的影响  121-128
      2.6.1 丛枝菌根真菌群落结构分析  121-123
      2.6.2 丛枝菌根真菌多样性分析  123
      2.6.3 丛枝菌根真菌代表条带序列分析  123-126
      2.6.4 环境因子对丛枝菌根真菌多样性的影响  126-128
    2.7 环境因子对免培养微生物多样性的影响  128-129
  3 讨论与结论  129-137
    3.1 烟草种植对免培养细菌的影响  129-131
    3.2 烟草种植对免培养放线菌的影响  131
    3.3 烟草种植对免培养真菌的影响  131-132
    3.4 烟草种植对免培养nifH基因的影响  132-133
    3.5 烟草种植对免培养硝化细菌的影响  133
    3.6 烟草种植对免培养丛枝菌根真菌的影响  133-134
    3.7 烟草种植对免培养总微生物的影响  134-135
    3.8 小结  135-137
第五章 综合成果、创新点与展望  137-139
  1 研究成果  137
  2 创新点  137-138
  3 展望  138-139
参考文献  139-149
致谢  149-150
攻读博士学位期间发表论文情况  150

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