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STOP1转录因子的克隆及其表达特性分析

作　者: 李莉
导　师: 李昆志
学　校: 昆明理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 酸性土壤 A1毒 STOP1 AtMGT1 苹果酸
分类号: S336
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


在热带和亚热带地区的发展中国家大约40%可耕种的土地是酸性土壤。在酸性土壤中,由于Al等离子对根系的毒害作用以及磷、钙和镁等营养元素的缺乏使农作物的生长受到抑制,其中A1是最主要的限制因素。在农业实践中常施用石灰改良土壤,但成本高且不能改良下层土壤。因此通过基因工程技术培育耐铝性植物品种是解决酸性土壤问题的持续有效方法。转录因子STOPL在参与A13+信号转导途径中起关键的转录调控作用。AtMGTl基因是拟南芥镁转运家族的一个成员,涉及Mg2+的转运,在高等植物中具有耐Al毒性的作用。本研究以模式植物拟南芥为材料,克隆耐Al的STOPL和AtMGTl基因,通过Gateway技术构建单基因和双基因植物表达载体,并转染烟草验证其功能特性。同时克隆大黄豆、丹波黑大豆、小黄豆及小黑豆耐铝基因STOPL,比较这些基因的一致性,以及这些基因的表达情况与根尖苹果酸分泌情况,探讨植物耐铝毒分子机理。获得主要研究结果如下：(1)通过PCR从拟南芥分离出STOPL和AtMGTL基因,并通过Gateway技术获得了拟南芥STOPL和AtMGTl的单基因植物表达载体PH7GW2.0-STOP1和PK2GW7.0-AtMGT1以及双基因GW3-STOP1-AtMGT1植物表达载体；并通过遗传转化获得了转单基因和双基因烟草株系。(2)丹波黑大豆、大黄豆、小黑豆、和小黄豆的STOP1基因蛋白在氨基酸序列上具有高度的一致性,其中丹波黑大豆与小黑豆、大黄豆、小黄豆的STOP1核酸序列分别具有95%、97%、95%的一致性,表明大豆STOP1基因具有多样性。(3)在不同时间梯度Al处理情况下,耐铝大黄豆STOP1基因表达量呈现先上升后下降的趋势,并在2小时呈现最大表达量。而丹波黑大豆STOP1基因的表达量在0.5小时呈现最大表达量,随后,表达量逐渐降低。随着A1离子浓度的增加,黑大豆和大黄豆的STOP1表达都呈现下降表达,且黑大豆表现更为明显。STOP1的表达对除Al之外的其它重金属不敏感。(4)在不同时间梯度铝处条件下,大黄豆根尖苹果酸分泌量在1小时处达到最大值,然后呈现逐渐下降趋势。丹波黑大豆根尖苹果分泌量在0.5小时达到最大值,然后呈现逐渐下降趋势。大黄豆和丹波黑大豆根尖苹果酸的分泌量对重金属处理不敏感,其分泌量与基因表达谱基本一致。以上研究结果表明不同耐铝大豆的STOP1基因间同源性高达95%以上,对铝处理敏感,而对重金属处理不敏感。Al胁迫能促进大豆STOPl基因的表达和苹果酸的分泌。与此同时获得了转来自拟南芥STOPl和AtMGTl单基因烟草和转STOPl和AtMGTl双基因烟草株系,这为研究STOPl基因功能和耐铝的分子机制奠定了基础。

全文目录


摘要  4-6Abstract  6-14第一章 前言  14-25  1.1 国内外农业环境现状  14-15  1.2 植物抵抗铝毒的两种机制  15-16    1.2.1 植物抵抗铝毒内部耐受机制  15    1.2.2 植物抵抗铝毒外部排斥机制  15-16  1.3 植物抵抗铝毒研究进展  16-18    1.3.1 铝诱导植物分泌有机酸的两种模式  16-17    1.3.2 有机酸缓解铝作用  17-18  1.4 通过分子育种解决植物铝耐受性问题  18-23    1.4.1 对锌指蛋白STOP1的研究  19-22    1.4.2 对转运蛋白AtALMT1表达的研究  22    1.4.3 Al激活柠檬酸和苹果酸转运蛋白赋予拟南芥耐A1性的研究  22-23    1.4.4 在烟草中过表达AtMGT1赋予拟南芥耐Al性的研究  23  1.5 本研究的目的与意义  23-25第二章 材料与方法  25-43  2.1 材料  25-29    2.1.1 植物材料及培养  25    2.1.2 菌株及质粒  25    2.1.3 主要试剂  25-26    2.1.4 主要培养基  26-28    2.1.5 抗生素及其他试剂  28-29    2.1.6 主要使用仪器  29  2.2. 实验方法  29-43    2.2.1 引物合成  29-30    2.2.2. 植物总RNA提取及RT-PCR  30-31    2.2.3 PCR反应体系  31-33    2.2.4 琼脂糖凝胶电泳  33    2.2.5 DNA片段的回收  33    2.2.6 DNA浓缩(乙醇沉淀法)  33-34    2.2.7 质粒DNA的转化方法  34    2.2.8 E.coli感受态细胞的制备  34-35    2.2.9 PCR产物的T/A克隆  35-36    2.2.10 DNA片段的连接  36    2.2.11 E.coli感受态大肠杆菌细胞的化学转化  36    2.2.12 限制性核酸内切酶消化DNA反应体系  36-37    2.2.13 Gateway LR反应体系  37    2.2.14 农杆菌感受态细胞(电转化用)的制备  37-38    2.2.15 电击转化农杆菌感受态细胞程序  38    2.2.16 菌落PCR  38-39    2.2.17 植物遗传转化(农杆菌介导法)  39    2.2.18 植物基因组提取  39-40    2.2.19 质粒的提取方法  40-41    2.2.20 植物根尖苹果酸含量及分泌量的测定  41-42    2.2.21 根相对伸长量的测定  42-43第三章 结果与分析  43-68  3.1 植物表达载体的构建  43-55    3.1.1 GW3.0-STOP1-AtMGT1植物表达载体的构建策略  43    3.1.2 pMD18-T-STOP1 TA克隆载体的构建  43-45    3.1.3 入门载体pENTR-2B-STOP1的构建  45-46    3.1.4 通过LR反应构建植物表达载体GW3.0-STOP1-AtMGT1  46-47    3.1.5 植物表达载体GW3.0-STOP1-AtMGT1转烟草  47-48      3.1.5.1 电转法转化质粒GW3.0-STOP1-AtMGT1  47      3.1.5.2 农杆菌介导的转基因烟草  47-48      3.1.5.3 外植体培育  48    3.1.6 PCR检测目的基因在烟草中的整合情况  48-49    3.1.7 植物表达载体pH7GW2.0--STOP1的构建策  49-50    3.1.8 通过LR反应得到植物表达载体pH7GW2.0-STOP1  50-51    3.1.9 PCR检测目的基因在烟草中的整合情况  51-52    3.1.10 植物表达载体载体Pk2GW7-AtMGTI构建策略  52-53    3.1.11 通过LR反应构建植物表达载体pk2gw7-AtMGT1  53-54    3.1.12 转基因植株对铝的抗性比较  54-55  3.2 大黄豆丹波黑大豆STOP1基因各种生理生化指标的测定  55-68    3.2.1 RT-PCR半定量分析在STOP1基因表达情况  55-56    3.2.2 大黄豆大黑豆根尖苹果酸分泌量的测定  56-60    3.2.3 大黄豆、丹波黑大豆、小黄豆、小黑豆STOP1基因序列比  60-68第四章 讨论  68-70第五章 总结和展望  70-72致谢  72-73参考文献  73-76附录  76

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中图分类: > 农业科学 > 农学（农艺学） > 作物遗传育种与良种繁育 > 生物技术育种方法
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