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茶树不同逆境条件下QRT-PCR适宜内参基因的筛选

作　者: 郝姗
导　师: 黎星辉
学　校: 南京农业大学
专　业: 茶学
关键词: 内参基因茶树逆境胁迫表达稳定性筛选
分类号: S571.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

茶树是我国重要的经济型作物,原产于热带及亚热带,是一种喜暖喜湿的叶用木本植物。我国茶区分布较广,地理范围在18°～38°N,94°～122°E,气候范围南起热带季风气候北至暖温带季风气候；地形分布复杂,包括平原、丘陵、山地和高原。这些地区经常出现季节性干旱、低温和重金属等引起的非生物逆境与病、虫害引起的生物逆境,从而造成春茶产量减少、品质下降和上市时间推后等问题,严重影响了春季名优茶的生产和经济效益。仅靠栽培措施来解决茶树逆境胁迫是不够的,抗逆育种已经成为一种重要途径。基于分子水平上的辅助选择正逐渐成为植物育种的有效工具,分离茶树抗逆性基因,筛选到与抗逆性性状紧密连锁的分子标记,就可以用于对茶树品种的抗逆性状进行早期鉴定及抗逆性状遗传的稳定性鉴定,这将大大缩短茶树抗逆性育种的周期,降低选育难度。而在转录水平进行基因表达定量的方法,如实时定量PCR、RNA印迹、核糖核酸酶保护分析、基因芯片等,在蛋白质水平进行定量的方法如蛋白质印迹等,都需要应用内参基因(reference gene)对目标基因表达量进行校正,以期获得真实可靠的结果。本实验利用同源克隆的方法克隆了茶树相关内参基因的部分片段,使用QRT-PCR的技术建立各基因对应的实时定量方法,并进一步研究了干旱、铝、冷、盐、伤害等不同逆境处理下相关内参基因表达的稳定性。具体研究结果如下：(1)利用同源克隆原理,以茶树叶片cDNA为模板,获得了7条内参基因(GAPDH, EF-1α、18S rRNA、TUA1、TUA2、ACT、UBI)的中间片段,经BLAST可知这7条基因与其他物种的同源基因具有高度相似性,碱基相似性均在80%以上,一方面说明实验结果是准确的,同时也证明了内参基因的保守性,进一步验证了其在分子生物学定量分析中的应用前景。(2)利用QRT-PCR技术,建立了7条基因对应的实时定量实验方法。以10倍稀释提纯质粒为模板,所得到的标准曲线具有很高的敏感性及相关性,并且能在高通量范围内显示cDNA样品的起始量。(3)以不同胁迫处理下的定量cDNA为模板,利用QRT-PCR技术,对前章实验中所得的7条内参基因的稳定性进行分析。经geNorm、BestKeeper及NormFinder三个生物学软件计算得出结论,不同处理条件下,内参基因的表达稳定性也不相同。结果表明在铝胁迫处理条件下,18S rRNA表现出了相对最为稳定的表达水平；冷胁迫下GAPDH与EF-1α都可应用于相关实验；伤害处理条件下则是TUA1及GAPDH为最佳内参基因；干旱胁迫处理的最佳选择是GAPDH;盐胁迫处理条件下Actin与GAPDH的表达稳定性最佳。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
第一章文献综述  10-22
  1.1 REAL-TIME PCR技术原理及应用进展  10-14
    1.1.1 实时定量PCR中荧光信号检测方法  10-12
    1.1.2 实时定量PCR方法学分类  12-14
  1.2 内参基因的研究现状  14-17
    1.2.1 常用内参基因  14-16
    1.2.2 常见内参基因的应用  16-17
    1.2.3 内参基因在茶树中的应用  17
  1.3 植物逆境分子生物学进展  17-20
    1.3.1 植物抗逆的分子生物研究现状  17-19
    1.3.2 茶树逆境下分子生物学进展  19-20
  1.4 研究目的意义与技术路线  20-22
    1.4.1 研究目的及意义  20
    1.4.2 本研究的技术路线  20-22
第二章茶树相关内参基因的克隆  22-38
  2.1 材料与方法  22-28
    2.1.1 材料  22
    2.1.2 实验方法  22-28
  2.2 数据处理及分析  28-30
    2.2.1 RNA提取  28
    2.2.2 PCR产物获得  28-29
    2.2.3 内参基因的序列比对  29-30
  2.3 讨论  30-38
第三章相关内参基因实时定量RT-PCR方法的建立  38-50
  3.1 材料与方法  38-41
    3.1.1 材料  38
    3.1.2 实验方法  38-41
  3.2 实验结果与分析  41-43
    3.2.1 重组质粒的鉴定  41-42
    3.2.2 融解曲线分析结果  42
    3.2.3 标准曲线的建立  42-43
  3.3 讨论  43-50
第四章茶树相关内参基因在不同胁迫下表达稳定性分析  50-64
  4.1 材料与方法  50-52
    4.1.1 材料  50-51
    4.1.2 实验方法  51-52
  4.2 数据处理与分析  52-63
    4.2.1 茶树相关内参基因特异引物的设计及特异性的检测  52
    4.2.2 内参基因在不同实验条件下的表达变化  52-55
    4.2.3 内参基因的表达稳定性评价  55-63
  4.3 讨论  63-64
    4.3.1 评价内参基因表达的重要性  63
    4.3.2 内参基因表达稳定性评价  63-64
总结与展望  64-66
参考文献  66-80
附录英文缩写词汇表/ABBREVIATIONS  80-82
致谢  82-84
攻读学位期间发表的学术论文目录  84

茶树不同逆境条件下QRT-PCR适宜内参基因的筛选

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