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小麦TaWRKY12基因的克隆、表达分析及其遗传转化研究

作　者: 马会
导　师: 杨广笑
学　校: 华中科技大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 小麦 WRKY 非生物逆境表达分析遗传转化
分类号: S512.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

WRKY蛋白是植物中的一类转录因子家族，它们通过特异性结合到靶标基因启动子中的W-box元件启动基因表达，在植物的生长发育过程以及对内外环境信号反应中起重要作用。小麦是一种重要的粮食作物，各种非生物胁迫，如干旱、冷冻和高盐等严重影响小麦的产量与品质。由于小麦是异源六倍体，其基因组结构非常复杂。目前，小麦中有关WRKY基因及其功能的研究报道相对较少。为了研究小麦中WRKY蛋白对逆境胁迫的响应，我们在生物信息学分析的基础上，利用RT-PCR技术从小麦幼苗cDNA中克隆了一个WRKY基因。基因序列比对发现该基因与大麦中的HvWRKY12基因有非常高的同源性，因此命名该基因为TaWRKY12。该基因编码的WRKY蛋白含有一个保守的WRKY结构域，锌指结构类型为C₂H₂型，属于Ⅱ类WRKY蛋白。利用半定量RT-PCR技术研究了TaWRKY12基因组织表达特异性，结果表明，该基因在小麦根组织中有较高水平的表达，而在茎组织中表达相对较低，在叶片中的表达量最低。为了研究TaWRKY12基因在非生物胁迫下的调控机制，我们对小麦幼苗进行了PEG-6000（20%）、NaCl（100mM）、ABA（100μM）以及低温（4℃）等胁迫处理，半定量RT-PCR分析结果显示，在上述各种处理中，高盐胁迫能特异上调TaWRKY12基因的表达，说明TaWRKY12在小麦响应盐胁迫反应中起重要作用。为进一步研究该基因在盐胁迫中的作用，我们构建了TaWRKY12基因过表达载体，通过基因枪轰击方法将其转化到郑麦9023盾片中，经组织培养获得再生植株。最后利用PCR检测Gus基因和Bar基因的方法鉴定出阳性植株。本实验共得到了6株阳性转基因小麦，其中4株为pAHC25-TaWRKY12基因过表达载体，2株为对照pAHC25表达载体。本研究为进一步深入研究TaWRKY12在小麦中的生物学功能奠定了坚实的基础。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-9
1 绪论  9-22
  1.1 植物中的WRKY转录因子  9
  1.2 WRKY转录因子的结构特点及分类  9-13
  1.3 WRKY转录因子的起源与进化  13-15
  1.4 WRKY转录因子的生物学功能  15-21
  1.5 本研究的目的意义  21-22
2 实验器材  22-24
  2.1 实验材料  22
  2.2 常用酶及化学试剂  22
  2.3 常见溶液和缓冲液：  22
  2.4 主要仪器设备  22-23
  2.5 所用软件及网址  23-24
3 实验方法  24-38
  3.1 小麦WRKY基因序列的筛选  24
  3.2 小麦RNA的提取和cDNA模板的制备  24-26
  3.3 小麦WRKY基因的克隆  26-31
  3.4 小麦WRKY基因的序列分析  31
  3.5 WRKY基因在胁迫处理下的表达分析  31-33
  3.6 载体构建  33-34
  3.7 基因枪转化及组织培养  34-36
  3.8 转基因阳性植株的鉴定  36-38
4 结果与分析  38-57
  4.1 小麦总RNA的提取及cDNA模板的制备  38-39
  4.2 TaWRKY12 基因的克隆及检测  39-41
  4.3 TaWRKY12 基因的生物信息学分析  41-46
  4.4 TaWRKY12 基因时空表达分析  46-48
  4.5 真核载体的构建  48-52
  4.6 基因枪转化及组织培养  52-54
  4.7 转基因阳性植株的鉴定  54-57
5 总结与展望  57-59
  5.1 总结  57-58
  5.2 展望  58-59
致谢  59-60
参考文献  60-68
附录 1 培养基配制  68-69

小麦TaWRKY12基因的克隆、表达分析及其遗传转化研究

内容摘要

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