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马铃薯青枯病关键防卫基因的生物信息学分析及验证

作　者: 智艳平
导　师: 郜刚
学　校: 山西师范大学
专　业: 植物学
关键词: 马铃薯青枯菌防卫相关基因生物信息学
分类号: S435.32
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

马铃薯（Solanum tuberosum）是重要的粮菜兼用作物，它在食物安全结构中具有举足轻重的地位。马铃薯青枯病（Bacterial Wilt）是由茄科雷尔氏菌（Ralstoniasolanacearum，俗称青枯菌）引起的毁灭性土传病害，马铃薯种植和生产常受青枯病的严重威胁。生物信息学（bioinformatics）是在人类基因组计划的背景下，生物信息学作为一门新的交叉学科应用而生。它的主要功能是研究DNA和蛋白质的序列，对遗传信息、进化信息以及生命物质的结构信息进行分析和预测。本研究从实验室前期利用抑制差减杂交技术构建的病原诱导后差异表达EST文库中，筛选青枯菌诱导上调表达基因，分别是：开心蛋白基因、蛋白酶抑制子基因、WRKY转录因子基因、印膜蛋白基因和四个金属硫蛋白基因。运用生物信息学的方法对其核苷酸序列、启动子以及预测的蛋白质氨基酸序列、蛋白质二级、超二级和三级结构进行分析，结果表明：五类基因具有防卫基因的属性。针对这些基因进行了诱导表达及组织定位分析：采用伤根灌菌法接种马铃薯抗、感病基因型，进行RT-PCR、qRT-PCR，结果表明该五类基因在马铃薯感染青枯菌早期基因的表达量都有不同的提高，且在与青枯菌互作的早期上调表达。整个过程中，抗病品种比感病品种的基因的表达量高。在感病马铃薯中，地高辛原位杂交实验显示蛋白酶抑制子基因的表达位点主要在叶的韧皮部，而茎中不是很明显，推测该基因与青枯菌引起的维管束系统病害有关。通过本研究中的生物信息学的分析与预测、实验验证方法，来进一步探究马铃薯与青枯菌互作早期其作用机制，期望为以后的马铃薯抗病育种提供理论依据和相关指导。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-10
1 绪论  10-14
  1.1 前言  10
  1.2 研究进展  10-12
    1.2.1 开心蛋白研究进展  10-11
    1.2.2 蛋白酶抑制子研究进展  11
    1.2.3 WRKY 转录因子研究进展  11-12
    1.2.4 印膜蛋白研究进展  12
    1.2.5 金属硫蛋白研究进展  12
  1.3 本论文的研究内容与目的及拟解决的关键问题  12-14
    1.3.1 研究目的  12-13
    1.3.2 研究内容  13-14
2 材料与方法  14-22
  2.1 材料  14
  2.2 方法  14-17
    2.2.1 全长 cDNA 序列获得  14-15
    2.2.2 序列生物信息学分析  15-17
      2.2.2.1 核苷酸序列分析  15-16
      2.2.2.2 基因启动子分析  16
      2.2.2.3 氨基酸序列一级结构分析  16
      2.2.2.4 氨基酸序列二级结构分析与预测  16
      2.2.2.5 蛋白质三级结构预测  16
      2.2.2.6 构建系统进化树  16-17
  2.3 RT-PCR 和 QRT-PCR 验证  17-19
    2.3.1 RNA 提取及检测  17
    2.3.2 引物设计  17-18
    2.3.3 RT-PCR  18
    2.3.4 qRT-PCR  18-19
  2.4 地高辛原位杂交  19-22
3 结果与分析  22-42
  3.1 开心蛋白基因的生物信息学分析及验证  22-26
    3.1.1 生物信息学分析  22-25
      3.1.1.1 核苷酸序列分析  22
      3.1.1.2 基因启动子分析  22
      3.1.1.3 氨基酸序列一级结构分析  22-23
      3.1.1.4 氨基酸序列二级结构分析与预测  23-24
      3.1.1.5 蛋白质三级结构预测  24
      3.1.1.6 构建系统进化树  24-25
    3.1.2 RT-PCR 和 qRT-PCR 验证  25-26
  3.2 蛋白酶抑制子基因的生物信息学分析及验证  26-30
    3.2.1 生物信息学分析  26-29
      3.2.1.1 核苷酸序列分析  26
      3.2.1.2 氨基酸序列一级结构分析  26-27
      3.2.1.3 氨基酸序列二级结构分析与预测  27
      3.2.1.4 蛋白质三级结构预测  27-28
      3.2.1.5 构建系统进化树  28-29
    3.2.2 RT-PCR 和 qRT-PCR 验证  29
    3.2.3 原位杂交  29-30
  3.3 WRKY 转录因子的生物信息学分析及验证  30-33
    3.3.1 生物信息学分析  30-32
      3.3.1.1 核苷酸序列分析  30-31
      3.3.1.2 氨基酸序列一级结构分析  31
      3.3.1.3 氨基酸序列二级结构分析与预测  31
      3.3.1.4 蛋白质三级结构预测  31-32
      3.3.1.5 构建系统进化树  32
    3.3.2 RT-PCR 和 qRT-PCR 验证  32-33
  3.4 印膜蛋白基因的生物信息学分析及验证  33-36
    3.4.1 生物信息学分析  33-36
      3.4.1.1 核苷酸序列分析  33
      3.4.1.2 氨基酸序列一级结构分析  33-34
      3.4.1.3 氨基酸序列二级结构分析与预测  34-35
      3.4.1.4 蛋白质三级结构预测  35
      3.4.1.5 构建系统进化树  35-36
    3.4.2 RT-PCR 和 qRT-PCR 验证  36
  3.5 金属硫蛋白基因的生物信息学分析及验证  36-42
    3.5.1 生物信息学分析  36-39
      3.5.1.1 核苷酸序列分析  36-37
      3.5.1.2 氨基酸序列一级结构分析  37-38
      3.5.1.3 氨基酸序列二级结构分析与预测  38-39
      3.5.1.4 构建系统进化树  39
    3.5.2 RT-PCR 和 qRT-PCR 验证  39-42
4 讨论  42-48
  4.1 五类基因生物信息分析与预测表明其都为青枯病防卫相关基因  42-44
  4.2 RT-PCR 实验和 QRT-PCR 实验证实五类基因参与马铃薯抗病过程  44-46
  4.3 原位杂交将蛋白酶抑制子基因定位于韧皮部  46-48
5 全文结论  48-50
致谢  50-52
参考文献  52-58
附录  58

马铃薯青枯病关键防卫基因的生物信息学分析及验证

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