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柠檬生物活性物质分离纯化及工艺研究

作　者: 全晓艳
导　师: 李玉锋
学　校: 西华大学
专　业: 食品科学
关键词: 柠檬总皂苷超氧化物歧化酶柠檬苦素锌多肽
分类号: TS255.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

柠檬（Citrus limon）中功能成分丰富，近年来随着经济发展，专家学者们越来越关注植物保健品的开发，柠檬具有降血糖、抗菌、抗氧化性等多种生物活性，奠定了其作为未来保健品的备选来源的基础，本论文对柠檬中总皂苷、柠檬苦素化合物、微量元素锌含量进行了测定，并测定了其中超氧化物歧化酶活力，对柠檬多肽进行了初步研究。本文采用大孔吸附树脂分离、纯化了柠檬中的总皂苷，建立了紫外分光光度法对其含量进行测定。结果表明10倍稀释柠檬皂苷提取液中总皂苷含量为27.1mg/L，20倍稀释柠檬皂苷提取液中总皂苷含量为27mg/L，对线性试验考察显示总皂苷以人参皂苷Re计在质量范围40~200μg内线性关系良好（R~2=0.9997）。平均加标回收率为102%、108.5%和111%。精密度和重复性表现良好，相对标准偏差分别为1.82%、1.5%。采用80%饱和度硫酸铵提取蛋白质的方法初步提取了柠檬中超氧化物歧化酶，并通过修改的Marklund法对其活力进行了测定，得柠檬粗酶提取液活力为25.99u/mL，2.0mg/mL酶标准液活力为332.42u/mL，重复性和精密度试验表现性良好，RSD为2.15%和2.16%。实验探讨了超临界二氧化碳萃取柠檬籽中柠檬苦素化合物工艺，并将最佳工艺条件下提取的样液经高效液相色谱进行了含量测定。柠檬苦素标准品在质量浓度40mg/L-80mg/L范围内线性关系良好（R~2=0.9993），柠檬籽中其含量为61.03mg/L，样品在4℃20h内稳定，重复性和精密度实验RSD分别为1.04%、1.63%。为了测定柠檬中微量元素锌的含量，样品按程序消解15min后，在最佳原子吸收光谱仪工作条件下对其含量进行测定，柠檬汁中锌含量为1.13μg/g。锌浓度在0.05μg/mL-0.6μg/mL范围内线型关系良好（R~2=0.9993）,加标回收率为91%、102.25%、105%。对测定不确定度进行了评估，其中对含量结果影响最大的主要是样品重复性测定、锌标准储备液的含量和最小二乘法拟合标准曲线计算含量，相对不确定度分别为0.59%、0.5%、0.274%，而锌标准溶液配制时使用的移液枪和容量瓶和样品消解液定容对测定结果影响较小，采用电子天平称量样品对测定结果的影响可以忽略不计。采用Khanan方法[96]初步分离柠檬中多肽，并采用超滤离心管截留得到5KD-30KD的柠檬多肽粗提物。茚三酮显色反应颜色变化为无色变为紫红色变为蓝色。经SDS-PAGE结果显示在10kD-15Kd范围内有条带出现。经反相高效液相色谱洗脱柠檬多肽粗提物与重组人胰岛素标准品，结果显示在几乎相同的保留时间有吸收峰出现。对柠檬样品梯度洗脱条件进行了选择，结果表明梯度洗脱条件较好的是：流动相流速为0.8mL/min，0-1min:A液为:90%、B液为10%；1-30min：A液为40%、B液为60%。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-11
1 引言  11-22
  1.1 柠檬概述  11-13
    1.1.1 柠檬基本情况  11-12
    1.1.2 柠檬主要研究进展  12-13
  1.2 柠檬中的功能成分  13-16
    1.2.1 皂苷  13-14
    1.2.2 超氧化物歧化酶  14-15
    1.2.3 柠檬苦素化合物  15
    1.2.4 锌  15-16
  1.3 多肽  16-18
    1.3.1 多肽提取  16
    1.3.2 多肽分离纯化  16
    1.3.3 多肽的功能活性  16-18
  1.4 本课题的研究意义、内容与技术路线  18-22
    1.4.1 研究意义  18
    1.4.2 研究内容与技术路线  18-22
2 紫外分光光度法测定总皂苷含量和超氧化物歧化酶活力  22-31
  2.1 实验材料  22-23
    2.1.1 实验原料与试剂  22-23
    2.1.2 实验仪器和设备  23
  2.2 总皂苷含量测定  23
    2.2.1 样品预处理  23
    2.2.2 柠檬总皂苷提取  23
    2.2.3 含量测定  23
  2.3 超氧化物歧化酶活力测定  23-24
    2.3.1 样品预处理  23
    2.3.2 活力测定  23-24
  2.4 结果与分析  24-30
    2.4.1 总皂苷  24-27
    2.4.2 超氧化物歧化酶  27-30
  2.5 小结  30-31
3 柠檬苦素化合物提取工艺及高效液相色谱法测定含量的研究  31-42
  3.1 实验材料  31-32
    3.1.1 实验原料与试剂  31-32
    3.1.2 实验仪器和设备  32
  3.2 超临界 CO_2萃取柠檬籽中柠檬苦素化合物工艺  32-33
    3.2.1 样品预处理  32-33
    3.2.2 工艺考察  33
  3.3 高效液相色谱法测定柠檬苦素化合物含量  33
  3.4 结果与分析  33-40
    3.4.1 超临界 CO_2萃取柠檬籽中柠檬苦素化合物工艺研究  33-38
    3.4.2 柠檬苦素化合物含量测定结果  38-40
  3.5 小结  40-42
4 原子吸收光谱法测定微量元素锌含量  42-52
  4.1 实验材料  42-43
    4.1.1 实验原料与试剂  42
    4.1.2 实验仪器和设备  42-43
  4.2 微量元素锌含量测定  43
    4.2.1 样品预处理  43
    4.2.2 样品微波消解技术路线  43
    4.2.3 梯度浓度锌标准品溶液配制  43
  4.3 结果与分析  43-46
    4.3.1 微波消解程序  43
    4.3.2 仪器工作条件  43-44
    4.3.3 标准曲线绘制  44
    4.3.4 精密度试验  44-45
    4.3.5 重复性试验  45
    4.3.6 柠檬样品消解液测定  45-46
    4.3.7 加标回收率试验  46
  4.4 测定结果不确定度分析  46-51
    4.4.1 数学模型  46-47
    4.4.2 不确定度分析  47-51
  4.5 小结  51-52
5 柠檬中多肽的分离纯化及初步鉴定  52-61
  5.1 实验材料  52-53
    5.1.1 实验原料与试剂  52
    5.1.2 实验仪器和设备  52-53
  5.2 柠檬多肽的分离纯化与检测  53-56
    5.2.1 柠檬多肽的分离  53-54
    5.2.2 薄层层析  54
    5.2.3 茚三酮显色反应  54
    5.2.4 反相高效液相色谱纯化  54-56
    5.2.5 SDS-PAGE 凝胶电泳  56
  5.3 结果与分析  56-60
    5.3.1 薄层层析  56-57
    5.3.2 茚三酮显色反应  57
    5.3.3 反相高效液相色谱纯化  57-59
    5.3.4 SDS-PAGE 凝胶电泳  59-60
  5.4 小结  60-61
结论  61-63
参考文献  63-68
攻读硕士学位期间发表的论文及科研成果  68-69
致谢  69-70

柠檬生物活性物质分离纯化及工艺研究

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