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加压CO₂杀菌机理初探及对乳中酶和细菌活性的影响

作　者: 姚春艳
导　师: 李晓东
学　校: 东北农业大学
专　业: 农产品加工及贮藏工程
关键词: 加压CO2 杀菌效果机理蛋白酶脂肪酶
分类号: TS252.41
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

加压CO2杀菌是指利用高于或接近于临界温度(31.1℃)和临界压力(7.13MPa)的CO2对食品进行杀菌的技术。CO2是一种天然、安全的杀菌剂,加压CO2杀菌技术的杀菌温度低,杀菌后可通过减压使CO2完全分离出来,被认为是一种非常有前途的冷杀菌技术。本课题的目的是首先研究加压CO2对生理盐水中细菌的杀菌效果、并分析影响因素和残存细菌活性；然后研究加压CO2的杀菌机理；再对比研究加压CO2与巴氏杀菌对原料乳天然菌群的杀菌效果及在贮藏期间天然菌群的生长情况；最后研究CO2对原料乳中蛋白酶和脂肪酶活性的影响及在贮藏期间酶活性的改变情况。将加压C02杀菌技术应用到乳品工业将是一项技术革新,通过本课题研究将为加压CO2冷杀菌技术提供理论依据,对使用加压CO2对乳及乳制品杀菌具有重要意义。使用加压CO2处理生理盐水中的大肠杆菌、荧光假单胞菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌。通过改变压力(1.5MPa、3MPa、4.5MPa、6MPa和7.5MPa)、时间(20min、40min、60min、80min和100min)、温度(30℃、35℃、40℃、45℃和50℃)、加压介质(生理盐水、脱脂乳和全脂乳)和加压方式(连续加压40min、间歇加压20min×2和间歇加压10min×4)研究影响杀菌效果的因素同时研究残存细菌活性的改变情况(30℃、7.5MPa、加压CO2连续处理20min、40min、60min)。结果表明加压CO2的杀菌效果随着压力、时间和温度提高而逐渐提高；牛乳成分对细菌具有保护作用；在低压下改变加压方式并不能显著(P>0.05)提高杀菌效果；加压CO2对4种菌的杀菌效果为：荧光假单胞菌>大肠杆菌>枯草芽孢杆菌>金黄色葡萄球菌；对革兰氏阴性菌的杀菌效果要好于革兰氏阳性菌；加压CO2对残存大肠杆菌和荧光假单胞菌具有后续破坏作用,使残存细菌的生长迟滞期发生显著延长(P<0.05),但对残存枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌并没有产生明显后续破坏作用,残存细菌的生长迟滞期并没有发生延长。使用加压CO2处理生理盐水中的大肠杆菌(7.5MPa,处理温度为25℃和45℃,处理时间为10min、20min、30min、40min、50min)和枯草芽孢杆菌(7.5MPa,处理温度为25℃和45℃,处理时间为20min、40min、60min、80min、100min)。与巴氏杀菌(63℃、30min)比较,通过检测细菌细胞膜通透性的改变情况,菌体内蛋白质、核酸、K+和Mg2+的泄漏情况,菌体超微结构和菌体DNA的改变情况,用FTIR分析菌体成分和菌体蛋白质二级结构的改变情况来综合研究加压CO2的杀菌机理。结果表明当加压CO2处理使菌体致死的过程中,细胞膜通透性显著(P<0.05)变大,但与热杀菌不同,没有发生全透改变；短时加压CO2处理不足以使菌体内蛋白质泄漏,长时加压CO2处理致使蛋白泄漏,并且泄漏量是显著(P<0.05)大于巴氏杀菌,但所需时间比99%以上菌体死亡时间明显滞后,所以只是细菌死亡后的后发结果；加压CO2处理使菌体内核酸发生显著(P<0.05)泄漏,菌体死亡与核酸泄漏有关；菌体死亡与加压CO2处理引起的菌体K+和Mg2+泄漏有关；加压CO2处理使菌体发生变形,破坏了菌体细胞壁和细胞膜,由此也证明菌体细胞膜通透性变大,菌体内成分发生泄漏。加压CO2处理后,菌体DNA没有发生明显降解,说明菌体死亡与菌体DNA损伤无关；通过FTIR分析可知,加压C02处理导致菌体脂肪酸发生改变,核酸物质发生改变,大肠杆菌的肽聚糖层发生明显改变,枯草芽孢杆菌的肽聚糖层变化并不明显,大肠杆菌的蛋白质性质发生改变,枯草芽孢杆菌的蛋白质性质发生不规律改变；与加热处理不同,C02处理使大肠杆菌蛋白质的α-螺旋结构减少,转变为β-折叠结构和β-转角结构,枯草芽孢杆菌蛋白质的β-折叠结构增加,α-螺旋结构、β-转角结构、无规卷曲结构的改变没有规律。使用加压C02处理原料乳。研究加压C02与巴氏杀菌对原料乳中天然菌群的杀灭效果以及对比研究了在贮藏期间处理后原料乳的稳定性。通过改变C02压力(4.5、7.5、10.5MPa)、加压时间(20、40、60min)、温度(4、15、25℃)和加压方式(连续加压和间歇加压)研究加压C02处理参数对杀菌效果的影响。在最适条件下在冷藏温度下加压C02处理对于原料乳中天然菌群的贮藏稳定性的影响也被研究,并且被比较和巴氏杀菌样品(63℃,30min)。结果表明原料乳中假单胞菌、肠杆菌科细菌、乳酸菌和金黄色葡萄球菌菌数降低,细菌总数也降低；C02压力、时间、温度对杀菌效果影响较大,加压方式的影响相对较小；对于加压C02处理原料乳中革兰氏阳性菌比革兰氏阴性菌更加具有抵抗力；在7.5MPa、4℃下,连续加压C02处理40min,原料乳中的金黄色葡萄球菌菌数降低到不能检测的水平,假单胞菌、肠杆菌科细菌和细菌总数降低到低于巴氏杀菌的水平,乳酸菌菌数高于巴氏杀菌水平；在贮藏期间,CO2处理原料乳中的假单胞菌、肠杆菌科细菌菌数和细菌总数低于巴氏杀菌,乳酸菌菌数高于巴氏杀菌,未检测出金黄色葡萄球菌：与巴氏杀菌相比,C02处理使原料乳的保藏期延长2天。使用加压C02处理原料乳(压力7.5MPa,温度25℃和45℃,时间20min和40min,连续加压)。结果表明与未处理原料乳蛋白酶活性3.61U/mL和脂肪酶活性0.43U/mL相比,CO2处理后不脱气时,CO2处理原料乳的蛋白酶活性(不同条件下分别为2.92U/mL、2.92U/mL2.40U/mL、2.20U/mL)和脂肪酶活性(不同条件下分别为0.25U/mL、0.26U/mL、0.16U/mL、0.12U/mL)都发生显著(P<0.05)降低；CO2处理后脱气时,原料乳的蛋白酶活性(不同条件下分别为3.30U/mL、3.42U/mL、3.24U/mL、3.21U/mL)发生较小(P>0.05)回升,脂肪酶活性(不同条件下分别为0.55U/mL.0.51U/mL、0.57U/mL、0.52U/mL)发生显著(P<0.05)提高；加压CO2处理能够抑制原料乳在贮藏过程中的蛋白质分解,著且短时加压的抑制作用更大,但温度对抑制作用的影响并不大；加压CO2处理导致原料乳在贮藏过程中脂肪分解程度变大,并且低温和长时加压的脂肪分解程度更大,脂肪分解加速是在加压CO2处理条件下原料乳的脂肪球变小所致。

全文目录

中文摘要  10-12
英文摘要  12-15
1 前言  15-29
  1.1 课题学术背景  15-16
  1.2 课题理论和实际意义  16-17
    1.2.1 理论意义  16
    1.2.2 实际意义  16-17
  1.3 国内外文献综述  17-27
    1.3.1 加压CO_2杀菌的试验设备  17-18
    1.3.2 加压CO_2的杀菌效果  18-19
    1.3.3 加压CO_2杀菌效果的影响因素  19-20
    1.3.4 加压CO_2的杀菌机理  20-22
    1.3.5 加压CO_2对食品中酶的影响  22-23
    1.3.6 加压CO_2杀菌技术在食品工业中的应用  23-27
  1.4 课题研究进展和待解决问题  27
  1.5 课题来源和研究内容  27-29
2 材料与方法  29-47
  2.1 试验材料  29-32
    2.1.1 试验原料  29
    2.1.2 主要试剂  29-30
    2.1.3 主要仪器与设备  30-32
  2.2 试验设计  32-38
    2.2.1 加压CO_2对生理盐水中细菌的杀菌效果  32-33
    2.2.2 加压CO_2杀菌机理的研究  33-35
    2.2.3 加压CO_2与热巴氏杀菌对原料乳中天然菌群杀菌效果的对比研究  35-37
    2.2.4 加压CO_2对原料乳中蛋白酶和脂肪酶活性的影响  37-38
  2.3 试验方法  38-47
    2.3.1 菌种的活化及传代方法  38
    2.3.2 菌悬液的制备方法  38
    2.3.3 加压CO-2的杀菌方法  38
    2.3.4 细菌菌数的测定方法  38-39
    2.3.5 加压CO_2杀菌效果的表示方法  39
    2.3.6 残存细菌活性的测定方法  39
    2.3.7 荧光染料PI的配制和使用方法  39
    2.3.8 菌体细胞膜通透率的测定方法  39
    2.3.9 菌体细胞内蛋白质泄漏量的测定方法  39-40
    2.3.10 菌体细胞内核酸泄漏的测定方法  40
    2.3.11 菌体细胞内K~+和M~(2+)泄漏的测定方法  40
    2.3.12 透射电镜样品的制备及观察方法  40-41
    2.3.13 菌体基因组DNA的提取方法  41-42
    2.3.14 琼脂糖凝胶电泳的检测方法  42
    2.3.15 傅里叶变换红外光谱的检测方法  42
    2.3.16 蛋白质二级结构图谱数据的处理方法  42
    2.3.17 原料乳样品的准备  42
    2.3.18 加压CO_2对原料乳样品的处理方法  42-43
    2.3.19 热巴氏杀菌的处理方法  43
    2.3.20 微生物数的测定方法  43-44
    2.3.21 pH值的测定方法  44
    2.3.22 蛋白酶活性的测定方法  44
    2.3.23 脂肪酶活性的测定方法  44-45
    2.3.24 游离氨基氮的测定方法  45
    2.3.25 游离脂肪酸的测定方法  45-46
    2.3.26 统计分析方法  46-47
3 结果与分析  47-112
  3.1 加压CO_2对生理盐水中细菌的杀菌效果  47-55
    3.1.1 加压CO_2杀菌的影响因素分析  47-52
    3.1.2 加压CO_2处理对残存细菌活性的影响  52-55
  3.2 加压CO_2杀菌机理的研究  55-93
    3.2.1 加压CO_2的杀菌效果  56-57
    3.2.2 加压CO_2处理后细菌细胞膜通透性的改变情况  57-60
    3.2.3 加压CO_2处理后菌体内蛋白质的泄漏情况  60-64
    3.2.4 加压CO_2处理后菌体内核酸的泄漏情况  64-65
    3.2.5 加压CO_2处理后菌体内K~+和Mg~(2+)的泄漏情况  65-69
    3.2.6 加压CO_2处理后菌体超微结构的改变情况  69-75
    3.2.7 加压CO_2处理后菌体DNA的改变情况  75-78
    3.2.8 用FTIR分析加压CO_2处理后菌体成分的改变情况  78-85
    3.2.9 用FTIR分析加压CO_2处理后菌体蛋白质二级结构的改变情况  85-93
  3.3 加压CO_2与热巴氏杀菌对原料乳中天然菌群杀菌效果的对比研究  93-104
    3.3.1 不同压力下加压CO_2与巴氏杀菌的杀菌效果的对比研究  94-95
    3.3.2 不同加压时间下加压CO_2与巴氏杀菌的杀菌效果的对比研究  95-96
    3.3.3 不同温度下加压CO_2与巴氏杀菌的杀菌效果的对比研究  96-98
    3.3.4 不同加压方式下加压CO_2与巴氏杀菌的杀菌效果的对比研究  98-99
    3.3.5 贮藏期微生物生长的对比研究  99-104
    3.3.6 贮藏期pH值改变的对比研究  104
  3.4 加压CO_2对原料乳中蛋白酶和脂肪酶活性的影响  104-112
    3.4.1 加压CO_2处理后未脱气对乳中蛋白酶和脂肪酶活性的影响  105-107
    3.4.2 加压CO_2处理后脱气对乳中蛋白酶和脂肪酶活性的影响  107-108
    3.4.3 加压CO_2处理原料乳贮藏过程中蛋白质分解和脂肪分解的变化情况  108-112
4 结论  112-113
致谢  113-114
参考文献  114-125
攻读博士学位期间发表的学术论文  125

加压CO2杀菌机理初探及对乳中酶和细菌活性的影响

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