学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

小麦NAC类转录因子的克隆和分子特征研究

作　者: 刘美英
导　师: 陈学平；赵昌平
学　校: 中国科学技术大学
专　业: 应用化学
关键词: 小麦 NAC类转录因子半定量RT-PCR 亚细胞定位转录激活活性非生物胁迫
分类号: S512.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 247次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

NAC(NAM/ATAF/CUC)转录因子是植物特有的转录调控因子,也是植物中最大的基因家族之一。NAC保守域的名称最初来源于矮牵牛NAM基因,拟南芥ATAF1、ATAF2和CUC基因的共有序列。NAC转录因子家族基因在植物生长发育、激素调节和防御抵抗多种生物和非生物胁迫、及作物产量和品质等方面发挥重要作用。其N端含有高度保守的DNA结合区,即NAM保守结构域,C端则高度变异,为转录激活区。小麦是重要的粮食作物,为世界数目众多的人口提供膳食营养,但是外部环境刺激和植物自身的遗传严重影响小麦的产量和质量。相比拟南芥和水稻,小麦NAC转录因子的研究相对较少,且多数研究集中在衰老和品质方面。本文系统研究了小麦‘京冬17’的15个NAC基因的分子特征,旨在挖掘潜在的抵抗逆境胁迫的,与发育密切相关的,及具有多种功能的优势基因,为基因工程改良农作物品质,提高植株的产量、抗逆性能提供良好的基础。本实验通过同源克隆的方法,从四种胁迫处理的小麦叶片(旱,盐,冷,ABA)及小麦不同器官(四叶期的叶片,根,茎,灌浆期的未成熟种子和衰老叶片)提取的总RNA中成功分离得到15个编码NAC转录因子的基因全长,本实验主要研究内容及结果如下:1.通过构建系统进化树并结合已知的NAC基因的功能、对小麦NAC基因进行了分类和初步的功能预测,结果表明本实验克隆得到的NAC基因主要可以分为三大类,逆境胁迫相关NAC,发育相关NAC,及跨膜NAC,其中3个跨膜NAC为小麦中首次发现的NAC类跨膜转录因子。2.利用半定量RT-PCR方法分析了TaNAC基因在干旱、高盐、低温和ABA处理下的表达情况,同时分析了它们的组织表达特异性。结果表明:TaNAC3,TaNAC4,TaNAC6,TaNAC12受一种以上胁迫处理诱导表达强烈;TaNAC5, TaNAC7,TaNAC8受胁迫诱导表达,但是转录水平mRNA表达量非常低; TaNAC9,TaNAC10,TaNAC11,TaNTL1,TaNTL2受胁迫诱导明显下调,由此可见,这些基因很可能在抗逆胁迫中发挥作用。在所检测的15个基因中,除TaNAC5,TaNAC7和TaNAC10,在各个组织中的表达量基本一致之外,其他基因在不同组织表现出明显的表达差异。我们推测这些基因可能在植物器官建成和形态发育过程发挥作用。3.基因枪法转化洋葱表皮细胞瞬时表达实验表明,TaNAC-GFP融合蛋白包括TaNAC1,TaNAC2,TaNAC3,TaNAC4,TaNAC5,TaNAC6,TaNAC7,TaNAC8,TaNAC12特异定位在细胞核中,它们是典型的转录因子;对于TaNTL1-GFP融合蛋白,全长基因融合蛋白主要定位在细胞膜上,极少部分定位在细胞核上,跨膜域缺失片段融合蛋白特异定位在细胞核中,因此TaNTL1作为跨膜转录因子行使功能,此外分析认为TaNTL2, TaNTL3同为跨膜转录因子。4.酵母转录激活实验、显色反应证明在酵母株系AH109体内,TaNAC2, TaNAC3,TaNAC4,TaNAC6,TaNAC8,TaNAC9,TaNTL1,TaNTL2,TaNTL3具有转录激活活性;TaNAC1,TaNAC5,TaNAC7,TaNAC10,TaNAC11, TaNAC12无转录激活活性。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-11
第一章绪论  11-22
  1.1 选题的背景和意义  11
  1.2 文献综述  11-20
    1.2.1 干旱胁迫  12-13
    1.2.2 转录因子简介  13-15
    1.2.3 NAC 转录因子研究  15-20
  1.3 实验方法和技术路线  20-22
    1.3.1 实验方法  20-21
    1.3.2 技术路线  21-22
第二章 NAC 基因的克隆及序列分析  22-35
  2.1 实验材料  22-24
    2.1.1 植物材料和菌株  22
    2.1.2 克隆载体  22
    2.1.3 酶及化学试剂  22
    2.1.4 培养基及溶液  22-23
    2.1.5 主要设备仪器  23
    2.1.6 引物序列  23-24
  2.2 实验方法  24-27
    2.2.1 实验材料处理  24
    2.2.2 总RNA 的提取  24-25
    2.2.3 cDNA 的合成  25-26
    2.2.4 RT-PCR 扩增目的基因  26
    2.2.5 PCR 产物的纯化回收  26-27
    2.2.6 PCR 产物的克隆测序  27
  2.3 序列分析  27-29
    2.3.1 多序列比对  28
    2.3.2 构建系统进化树  28-29
  2.4 实验结果  29-33
    2.4.1 植物组织总RNA 样品质量检测  29
    2.4.2 目的基因片段的克隆  29-30
    2.4.3 多序列比对和系统进化树  30-33
  2.5 讨论  33-35
    2.5.1 多序列比对结果讨论  33
    2.5.2 系统进化树  33-35
第三章 TaNAC 基因表达特性分析  35-43
  3.1 实验材料处理及总RNA 的提取  35
  3.2 半定量RT-PCR 引物的设计  35-36
  3.3 NAC 家族成员在不同胁迫条件下的表达特性分析  36
  3.4 NAC 家族成员组织表达特异性分析  36
  3.5 实验结果分析  36-40
    3.5.1 胁迫处理表达特性分析  36-38
    3.5.2 干旱胁迫和ABA 处理下表达趋势的比对  38-39
    3.5.3 组织表达特异性分析  39-40
  3.6 讨论  40-43
    3.6.1 三种胁迫处理下的表达趋势  40-41
    3.6.2 旱胁迫和外源ABA 条件下的表达关系  41
    3.6.3 组织表达特异性  41-43
第四章 TaNAC 转录因子亚细胞定位分析  43-51
  4.1 绿色荧光蛋白(GFP)简介  43-44
  4.2 实验材料与仪器  44
  4.3 亚细胞定位所用引物的设计  44
  4.4 亚细胞定位载体的构建  44-45
    4.4.1 载体构建过程  44-45
    4.4.2 163GFP 载体结构图谱  45
  4.5 基因枪法转化洋葱表皮细胞  45-47
    4.5.1 洋葱表皮细胞的培养  45-46
    4.5.2 金粉制弹  46
    4.5.3 基因枪轰击操作流程  46-47
    4.5.4 洋葱表皮细胞镜检  47
  4.6 亚细胞定位结果  47-50
  4.7 亚细胞定位讨论  50-51
    4.7.1 亚细胞定位预测  50
    4.7.2 跨膜转录因子  50-51
第五章 TaNAC 转录激活活性鉴定  51-59
  5.1 酵母单杂交系统的原理  51
  5.2 材料  51-52
    5.2.1 菌种和载体  51-52
    5.2.2 酶及化学试剂  52
    5.2.3 试剂盒  52
    5.2.4 引物及测序  52
  5.3 TaNAC 和PGBKT7 融合表达载体的构建  52-54
    5.3.1 转录激活引物设计  52-53
    5.3.2 融合表达载体的构建  53-54
  5.4 酵母感受态细胞的制备和质粒的转化  54-56
    5.4.1 所用试剂及配制方法  54-55
    5.4.2 感受态细胞的制备  55
    5.4.3 质粒的转化  55-56
  5.5 β-半乳糖苷酶活性滤膜影印分析  56
  5.6 实验结果  56-58
  5.7 转录激活实验讨论  58-59
第六章结论  59-62
参考文献  62-69
附录  69-70
致谢  70-71
在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果  71

小麦NAC类转录因子的克隆和分子特征研究

内容摘要

全文目录

相似论文