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1.胃癌下调功能基因组的筛选与下调新基因的克隆 2.胃癌下调新基因CA11的克隆、细胞定位和功能研究

作　者: 杜建军
导　师: 窦科峰
学　校: 第四军医大学
专　业: 外科学
关键词: 下调基因抑癌基因新基因基因微阵列 SSH文库 CA11 细胞定位功能研究
分类号: R735.2
类　型: 博士论文
年　份: 2002年
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内容摘要

采用cDNA基因微阵列技术，五人份胃癌与相对应正常胃粘膜mRNA反转录为探针，与含有18000个分别来自正常肝库、肝癌库、肾上腺库、垂体库、下丘脑、DC库的基因点阵，以及1200个肿瘤相关基因点阵的Microarray尼龙膜杂交。经计算机平行化分析，筛选到67个胃癌下调基因，其中包括抑癌基因，凋亡相关基因，DNA复制、转录、翻译相关基因，细胞周期相关基因，细胞迁移相关基因，免疫相关基因，神经生长因子及其受体家族基因等。揭示了胃癌的发生发展，是多基因、多过程、多阶段异常的结果，它们共同作用导致胃癌的发生、发展与转移。采用抑制消减杂交技术，建立五人份正常胃粘膜mRNA(Tester)抑制消减杂交胃癌mRNA(Driver)的差异表达cDNA文库，用PCR及差异表达克隆菌转膜反向杂交判定其消减效率。随机挑选反向杂交阳性克隆测序，寻找胃癌下调新基因。结果证实该文库具有特异性高、假阳性率低、克隆低丰度差异基因高度灵敏的突出优点。克隆到两个低丰度mRNA表达的胃癌下调新基因片段，命名为GDDZ与GDDR。分别均经半定量RT-PCR证实为胃癌下调新基因。GDDZ、GDDR经cDNA末端快速扩增，长度分别延至802bp、751bp，得到了GDDR的全长基因。GDDZ与GDDR均被国际GenBank收录，收录号：AF494508(GDDZ)，AF494509(GDDR)。胃癌下调全长新基因GDDR，第四早匠大学协文中文拈耍其编码蛋白与候选抑癌基因 CAll编码蛋白为同源蛋白，GDDR及 GDDZ可能在胃癌的发生发展及转移中具有重要意义。从己成功建立的五人份正常胃粘膜mRNA抑制消减杂交胃癌mRNA的差异表达文库，随机挑取阳性克隆测序为 CA，O旺读框 600hP，编码 199 个氨基酸。CAll 为一刚刚发现的新基因，性质功能都不知道。网上功能提示可能为一分泌肽。Northern blot、RT－PCR证实其为胃癌下调基因。在其它 13种组织器官中扩增此基因双在胃组织中有表达。地高辛标记 CA 11 原位 mRNA杂交，结果显示CAll位于胃粘膜卜皮细胞。将CAll克隆至带有Myc 检测标签，以及m 纯化标签的真核表达载体pCDNA3．l／MyC－H以－八。瞬时转染 CAll的 COS－7细胞，生长至对数生长期时吸取培养液，Talon金属亲和树脂吸附、洗脱后洗脱液SDS－PAGE蛋白电泳，用抗C－MyC标签的一抗行做＊＊inN ＊1，结果未检狈到＊Al互帅＊融合蛋白表达条带：＊All 转染＊OS－7 细胞后加抗C－MyC标签的一抗，最后加 FITC标记的二抗，荧光显微镜下观察其融合表达蛋白位于细胞浆。最后在CAll稳定转染胃癌7901细胞系中，用抗 C－MyC标签的一抗细胞免疫组化染色，终于抓住了 CA 11－MyC融合表达蛋白从胞浆到穿膜，至分泌到细胞间隙的整个过程。首次证实 CAll基因编码蛋白是一分泌肽。 CAll稳定转染胃癌细胞系7901，经RT－PCR、Western blot及CAll融合蛋白表达的细胞水平观察，均证实 CA被稳定转染入胃癌细胞并表达。生长曲线表明转染 CAll细胞较转染空载质粒 PCDNA3．l恤yC－HIS卜）A生长明显抑制；MTT检测结果显示转染CAll胃癌细胞系79m A值呈显著下降趋势，即较转染空载质粒pCDNA3．IMyC－H此一A胃癌细胞系7901生长缓慢（72h，0．379上0．019 A VS 0．467士0刀ZIA，P＜0＊1）。裸鼠荷瘤实验亦表明，CAll 能显著抑制胃癌细胞的生长。形态学观察可见，较对照组空载转染 790细胞， CAll稳定转染胃癌 7901细胞系形态不规则，核糖体、胞膜纤毛明显减少。 — —4一第四军医大学俗士论文中文幻县转染 CAll的胃癌 7901细胞较对照组空载转染 7901细胞，GI期增多而 S期减少。CAll与多种己知抑癌基因、癌基因并无相互调节的关系。CAll稳定转染肝癌 HepGZ细胞系，对其生长无明显影响。这些结果均提示，CA能明显抑制胃癌细胞的生长，使肿瘤的表型发生变化。CA 很可能为一具有胃组织特异性、功能强大的抑癌候选基因，其机制是通过影响胃癌细胞民至 S期的转化发挥作用。CAll可能不是一作用广泛的候选抑癌基因。为寻找与 CAll相互作用。结合蛋白，揭示 CAll抑癌作用的通路，成功构建了 C川 l酵母双杂交诱饵 PGBKT7载体。

全文目录

英文缩略词表  4-6
中文摘要  6-9
英文摘要  9-12
前言  12-14
文献回顾  14-43
第一部分 Microarray基因微阵列筛选胃癌下调功能基因组  43-62
  一．材料与仪器  43-44
  二．方法  44-50
  三．结果  50-56
  四．讨论  56-61
  五．结论  61-62
第二部分胃癌下调基因SSH cDNA文库的建立与下调新基因的克隆  62-90
  一．材料与仪器  62-63
  二．方法  63-78
  三．结果  78-85
  四．讨论  85-89
  五．结论  89-90
第三部分胃癌下调新基因CA11的克隆、细胞定位和功能研究  90-121
  一．材料与仪器  90-92
  二．方法  92-103
  三．结果  103-109
  四．讨论  109-113
  五．抑癌模式的提出与展望  113-114
  六．结论  114-121
小结  121-123
参考文献  123-131
致谢  131-133
附录：攻读博士期间发表论文目录及获奖情况  133

1.胃癌下调功能基因组的筛选与下调新基因的克隆 2.胃癌下调新基因CA11的克隆、细胞定位和功能研究

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