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牛瑟氏泰勒虫18S rRNA基因的克隆及PCR诊断方法的建立

作　者: 沈岩
导　师: 许应天
学　校: 延边大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 牛瑟氏泰勒虫 18S rRNA基因克隆 PCR诊断方法
分类号: S858.23
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 25次
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内容摘要

牛瑟氏泰勒虫病是由泰勒科、泰勒属的瑟氏泰勒虫(Theileria sergenti)寄生于牛红细胞和淋巴细胞而引起的一种血液原虫病。近些年,瑟氏泰勒虫病的发生呈上升趋势,给相关国家的畜牧业带来了较大的经济损失,引起了国内外兽医界的广泛关注。因此有必要建立一种快速、敏感、特异诊断方法,以便进行牛瑟氏泰勒虫病的早期诊断和预防。本试验根据GenBank中报道的牛瑟氏泰勒虫18S rRNA基因序列,设计了两对特异性引物,扩增两条特异性基因片断,再去除重复区,经过拼接得到牛瑟氏泰勒虫18S rRNA基因全序列,进行核苷酸序列分析及同源性比较。再以牛瑟氏泰勒虫18SrRNA基因为靶基因,设计特异性引物建立PCR诊断方法,并进行应用试验。结果表明,PCR扩增出长为1 173 bp和1 440 bp两条特异性基因片断,去除重.复区拼接得到全长为1 744 bp的牛瑟氏泰勒虫18S rRNA基因序列。同源性比较结果表明,牛瑟氏泰勒虫(Theileria sergenti)与水牛泰勒虫(Theileria buffeli)同源性最高,为99%,与突变泰勒虫同源性最低,为95%。建立的PCR诊断方法不与新孢子虫、弓形虫、羊泰勒虫发生交叉反应,最高敏感度DNA为5.3 fg/μL。对50份样本DNA进行检测,本方法阳性检出率(64.0%)高于金春梅方法阳性检出率(58%)。本研究为我国瑟氏泰勒虫分子分类学、遗传学以及诊断工作奠定理论基础,为牛瑟氏泰勒虫病的诊断、流行病学调查提供特异、快速、灵敏、简便、高效的诊断方法,以便有效地控制该病的发生与流行。

全文目录

摘要  6-7
ABSTRACT  7-10
前言  10-18
  1 牛瑟氏泰勒虫病概况  10-12
  2 牛瑟氏泰勒虫病诊断技术研究进展  12-16
  3 18S RRNA基因的研究进展  16-17
  4 本研究的目的和意义  17-18
材料与方法  18-27
  1 材料  18-21
    1.1 阳性血液来源  18
    1.2 菌种  18
    1.3 主要试剂  18
    1.4 特异性试验材料  18
    1.5 主要仪器  18
    1.6 试验用溶液及其配制  18-21
  2 方法  21-27
    2.1 血液采集  21
    2.2 血液涂片检查  21
    2.3 不同血液抗凝剂抗凝效果的比较  21
    2.4 牛瑟氏泰勒虫DNA的提取及样品质量的比较  21-22
    2.5 PCR引物设计与合成  22
    2.6 PCR扩增  22-23
    2.7 PCR产物的鉴定  23
    2.8 PCR产物的纯化与克隆  23-25
    2.9 核苷酸序列的测定及分析  25-26
    2.10 PCR诊断方法的建立  26
    2.11 应用试验  26-27
结果  27-35
  1 不同血液抗凝剂抗凝效果的比较  27
  2 提取的DNA样品质量的比较结果  27-28
    2.1 DNA样品的紫外吸收值  27-28
    2.2 DNA样品琼脂糖凝胶电泳  28
  3 PCR扩增结果  28-29
  4 重组质粒的鉴定结果  29
    4.1 重组质粒的PCR鉴定  29
    4.2 重组质粒的酶切鉴定  29
  5 核苷酸序列的测定及分析  29-31
    5.1 核苷酸序列测定结果  30
    5.2 核苷酸序列分析  30-31
  6 PCR诊断方法的建立  31-33
    6.1目的基因的PCR扩增、测序及序列比较  31
    6.2 退火温度的筛选  31-32
    6.3 特异性试验  32
    6.4 敏感性试验  32-33
  7 应用试验  33-35
讨论  35-38
结论  38-39
参考文献  39-44
致谢  44-45
作者简介  45

牛瑟氏泰勒虫18S rRNA基因的克隆及PCR诊断方法的建立

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