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猪的六种常见致病菌基因芯片检测技术的研究

作　者: 程亚楼
导　师: 李文刚
学　校: 河南农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪 致病菌 基因芯片 16-23S rRNA基因 寡核苷酸探针
分类号: S852.61
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


细菌病在我国不同规模的养猪场常年不断发生，特别是病毒病在猪群中流行时，细菌病往往都会出现，出现混合感染或继发感染，致使猪群的发病率和死亡率都有很大程度提高，给我国的养猪业造成巨大的经济损失。当前，免疫抑制性疾病在猪群中普遍存在，致病菌新的血清型不断出现，抗生素滥用造成细菌耐药性不断提高，甚至出现超级细菌，而且猪场和社会的生物安全措施不健全、不到位，这些不利的情况给我国猪病的治疗和防控工作带来很大的困难。通过对规模化养猪场送检的病料进行细菌学分离鉴定，发现细菌分离的阳性率高达82%。分离的细菌主要有链球菌、副猪嗜血杆菌、大肠杆菌、肺炎支原体、多杀性巴氏杆菌、传染性胸膜肺炎放线杆菌、沙门氏菌和附红细胞体等。因此，为了我国养猪业的健康发展，在重视对猪的病毒性疾病防控的同时，我们一定也要加强对细菌性疾病的预防和治疗，以确保猪只的健康生长，而对细菌有效的鉴定是重要前提。临床上鉴定病原菌常用的方法有分离培养技术、免疫学技术和PCR技术等，这些方法虽然都非常有效，但是各有缺点。基因芯片技术的出现，为致病菌的鉴定开辟了新的道路，它是分子生物技术与微电子技术融合的结晶，将大量已知的核苷酸序列固定于固相载体表面，通过碱基互补配对原则与标记的靶基因杂交，再对杂交信号进行扫描分析，可快速、准确的对致病菌作出鉴定。由于其微量、快速、准确、高通量等的优点，定会成为新一代的自动化疫病检测工具。以多杀性巴氏杆菌、猪大肠杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、猪链球菌6种猪常见致病菌为目标细菌，16-23S rRNA基因为靶基因，从GenBank中下载它们16S rDNA、16-23S rDNA、23S rDNA的全序列，在16-23S rDNA的变异区设计针对6种细菌的特异性探针，在16S rDNA、23S rDNA的保守区设计通用引物。通过序列分析、靶标与探针杂交试验、杂交条件优化试验建立了由6条寡核苷酸探针和1对通用引物构成的猪常见致病菌基因芯片的检测方法。用参考菌株全基因组作为模板做PCR得到靶标，通过每种靶标与相应探针杂交，检出芯片的特异性良好。通过对芯片杂交条件的优化，发现PCR扩增产物和杂交缓冲液1:4混匀在45℃水浴锅中与探针杂交1h，可获得理想的杂交结果。初步研究证明，该方法能快速、有效地鉴定多种猪常见致病菌。总之，本研究将基因芯片检测技术应用于动物致病菌的检测，成功构建了6种猪常见致病菌基因芯片检测技术平台，具有重大的理论意义和应用价值。为今后利用基因芯片技术进行动物细菌病诊断和研究提供理论依据，也为控制和消灭疫情奠定基础。

全文目录


致谢  4-10
摘要  10-11
第一章 文献综述  11-31
  1 基因芯片技术及其应用与发展  11-21
    1.1 基因芯片技术  11-12
      1.1.1 基因芯片技术的概念  11-12
      1.1.2 基因芯片技术的原理  12
      1.1.3 基因芯片的分类  12
    1.2 基因芯片技术的操作流程  12-15
      1.2.1 基因芯片的设计  13
      1.2.2 载体材料的预处理  13
      1.2.3 基因芯片的制备  13-14
        1.2.3.1 原位合成法  13-14
        1.2.3.2 合成点样法  14
      1.2.4 靶基因的制备和标记  14
      1.2.5 芯片的杂交反应  14-15
      1.2.6 杂交信号的扫描和分析  15
    1.3 基因芯片检测技术的应用  15-20
      1.3.1 单核苷酸多态性（SNP）的鉴定  15
      1.3.2 基因表达分析  15-16
      1.3.3 克隆选择及文库筛选  16
      1.3.4 基因突变检测及在遗传病和肿瘤诊断中的应用  16-17
      1.3.5 在微生物检测中的应用  17-18
        1.3.5.1 研究病毒的抗药和致病机制  17
        1.3.5.2 对病原体进行鉴定和分型  17-18
        1.3.5.3 研究宿主与病原体的相互影响  18
      1.3.6 在药物研究中的应用  18-20
        1.3.6.1 发现药物靶标  18
        1.3.6.2 筛选新药  18-19
        1.3.6.3 在毒理学研究中的应用  19
        1.3.6.4 指导临床合理用药  19
        1.3.6.5 在中医药研究中的应用  19-20
    1.4 基因芯片技术的发展前景  20-21
  2 致病菌检测技术的研究进展  21-31
    2.1 传统的鉴定方法  21-24
      2.1.1 菌落形态学观察  21
      2.1.2 细菌个体形态学观察  21-22
      2.1.3 生化试验  22
      2.1.4 常规血清学检测技术及免疫标记检测技术  22-24
        2.1.4.1 常规血清学检测技术  22
        2.1.4.2 酶标法（ELISA）  22-23
        2.1.4.3 磁珠法(immunomagnetie separation，IMS)  23
        2.1.4.4 金标法(immunogold labelling technique)  23
        2.1.4.5 酶联荧光法（VIDAS）  23
        2.1.4.6 免疫印迹法（immunoblot assay）  23-24
      2.1.5 细菌毒力的测定  24
    2.2 自动化微生物分析仪  24
    2.3 分子生物学技术  24-31
      2.3.1 G-C mol%含量  25
      2.3.2 质粒图谱分析法（Plasmid profile analysis，PPA）  25-26
      2.3.3 PCR 技术  26
      2.3.4 核酸杂交技术  26-27
      2.3.5 限制性核酸内切酶分析法  27
      2.3.6 rDNA 鉴定法  27-31
        2.3.6.1 16S rRNA 基因  28-29
        2.3.6.2 23S rRNA 基因  29
        2.3.6.3 16S-23S rRNA 基因间区  29-31
第二章 试验研究  31-49
  试验一 六种猪常见致病菌基因芯片的构建  31-42
    1 引言  31
    2 材料与方法  31-36
      2.1 材料  31-32
        2.1.1 参考标准菌株  31-32
        2.1.2 主要试剂  32
        2.1.3 主要仪器  32
        2.1.4 芯片材料  32
      2.2 方法  32-36
        2.2.1 细菌的培养  32-33
        2.2.2 模板的制备及注意事项  33-34
          2.2.2.1 提取细菌基因组 DNA  33
          2.2.2.2 提取过程中的注意事项  33-34
        2.2.3 探针的设计  34
        2.2.4 探针的合成  34
        2.2.5 寡核苷酸芯片的制备  34
          2.2.5.1 芯片阵列的设计  34
          2.2.5.2 芯片的点样及处理  34
        2.2.6 引物的设计合成和靶序列扩增  34-35
        2.2.7 靶标的检测  35
        2.2.8 基因芯片的杂交  35
        2.2.9 基因芯片的洗涤和干燥  35
        2.2.10 基因芯片的扫描及扫描结果判定依据  35-36
    3 结果  36-39
      3.1 引物设计结果及其通用性检测  36-37
      3.2 探针特异性检测  37-39
      3.3 不对称 PCR 和引物比例的优化  39
    4 讨论  39-42
  试验二 基因芯片杂交条件的优化  42-49
    1 材料与方法  42-45
      1.1 材料  42-43
        1.1.1 标准菌株  42
        1.1.2 主要试剂  42
        1.1.3 主要仪器  42-43
        1.1.4 芯片材料  43
      1.2 方法  43-44
        1.2.1 细菌的培养  43
        1.2.2 模板的制备  43
        1.2.3 使用的探针  43
        1.2.4 芯片的点样及处理  43-44
        1.2.5 靶序列扩增  44
        1.2.6 基因芯片的杂交  44
        1.2.7 基因芯片的洗涤和干燥  44
        1.2.8 基因芯片的扫描及扫描结果分析  44
      1.3 杂交条件优化  44-45
        1.3.1 探针间隔臂（spacer）的优化  44
        1.3.2 杂交温度的优化  44-45
        1.3.3 杂交时间的优化  45
        1.3.4 靶标浓度的优化  45
    2 结果  45-47
      2.1 有无间隔臂（spacer）对杂交结果的影响  45
      2.2 不同杂交温度对杂交结果的影响  45-46
      2.3 不同杂交时间对杂交信号的影响  46-47
      2.4 不同靶标浓度对杂交信号的影响  47
    3 讨论  47-48
    4 全文总结与创新点  48-49
      4.1 全文总结  48
      4.2 本研究的创新点  48-49
参考文献  49-59
ABSTRACT  59-61
发表论文  61-62
附录  62-64
  附录 1：主要培养基和溶液的配制  62-63
  附录 2：缩略词  63-64

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 病原细菌
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