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重组猪源OAS1抗日本脑炎病毒的特性研究

作　者: 刘维婷
导　师: 陈溥言；曹瑞兵
学　校: 南京农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪OAS1 日本脑炎病毒(JEV) 抗病毒作用机制
分类号: S852.651
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

2’-5’寡腺苷合成酶(2’-5’oligoadenylate synthetases,OAS)是哺乳动物先天性免疫系统的重要成分,OAS蛋白传统上认为是细胞内的抗病毒蛋白。它的本质是一种干扰素诱导的抗病毒蛋白。细胞内的OAS/RNaseL信号通路在宿主控制黄病毒、呼肠孤病毒和脑心肌炎病毒的先天性免疫反应中起重要作用。此外,近年来已有研究证实OAS存在不依赖于RNaseL途径的抗病毒作用。OAS蛋白能直接抑制病毒增殖而不需要已知的抗病毒信号通道的激活。小鼠、马和人中均发现OAS基因是抗黄病毒感染的生物标志基因,猪源与人源OAS1蛋白的氨基酸同源性为73%,具有相似的酶学特征,因此进一步研究猪是否也存在抗黄病毒(JEV)感染的生物标记基因以及OAS基因是否就是猪感染JEV致病的风险标志基因是必要的。鉴于日本乙型脑炎在中国的严重危害及其传播范围广泛；JEV疾病给养猪业带来了严重的经济损失,以及猪作为中间宿主在JEV传播过程中的重要作用,研究猪OAS在抗JEV感染中的作用及其分子机理具有重要的意义。本研究设计方案主要包括以下几个内容：1.重组OAS1蛋白的可溶性表达与纯化根据已发表的猪源OAS1的基因序列设计引物,利用RT-PCR的方法从PK细胞中扩增出猪源OAS1基因,其长度为1050bp,并将其与pMD18-T simple载体进行连接和测序鉴定。将鉴定正确的目的基因与pET28a(+)载体相连,构建原核表达的重组质粒,将其转化到大肠杆菌Rosetta2(DE3)中,经0.1mmol/LIPTG低温过夜诱导表达,SDS-PAGE结果显示得到了大量溶解性好的猪源OAS1蛋白,蛋白分子量大小约为40KDa.通过载体上的His标签及利用亲和层析的原理,用镍柱对表达的蛋白进行纯化。结果得到稳定且较为纯净的目的蛋白,SDS-PAGE鉴定结果表明,蛋白纯度达95%以上。用纯化的目的蛋白免疫小鼠制备特异性多抗血清,Western blot结果显示该抗血清与猪源OAS1蛋白相互作用后有明显的特异性条带。该研究为猪源OAS1蛋白抗病毒的效果鉴定与机制研究奠定了基础。2.重组OAS1蛋白抗病毒特性的研究分析纯化原核表达猪源OAS1蛋白,用脱盐柱对蛋白进行脱盐处理,并用MTT比色法检测外源蛋白对细胞存活和生长的影响。结果表明,经脱盐处理的蛋白在低浓度条件下(200μg/mL),对细胞的生长和活性几乎没有影响。通过Real Time PCR的方法检测猪源OAS1蛋白在PK细胞系对伪狂犬病毒的抗病毒效果,以及在Marc-145细胞系对猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)和在BHK-21细胞系上对日本乙型脑炎病毒(JEV)抑制病毒感染细胞的活性,结果表明外源表达的猪源OAS1蛋白具有广谱的抗病毒活性,对DNA病毒和RNA病毒均有抑制病毒感染细胞的活性。用蛋白预处理细胞能显著降低细胞内病毒的DNA或mRNA水平。且抑制病毒感染细胞的效果呈剂量依赖关系。就我们检测结果而言,尤其是蛋白在BHK-21细胞上抑制JEV感染细胞效果最为显著。当蛋白浓度为200μg/mL,对照组细胞中JEV的mRNA水平是蛋白预处理组中JEV的mRNA水平的8.04倍。并在病毒感染细胞的不同阶段用猪源OAS1蛋白处理细胞,通过Real Time PCR的方法和空斑减少试验来检测猪源OAS1蛋白抑制病毒感染细胞的最佳作用时间,结果发现,蛋白浓度在100μg/mL预处理细胞能显著抑制病毒感染细胞,并抑制病毒在细胞内复制,降低子代病毒的数量,而蛋白对病毒本身几乎没有作用,对病毒无钝化作用；用蛋白处理接毒后的感染细胞时,发现猪源OAS1蛋白(100μg/mL)仍有一定的抑制病毒感染细胞的效力,但是效果不明显。因此,猪源OAS1蛋白在抑制病毒感染细胞时主要是通过用它来预处理细胞,激活下游的信号通路,使得病毒无法在细胞内增殖,而蛋白对病毒本身几乎没有影响,对已感染病毒的细胞抗病毒效果不佳。这为我们进一步研究猪源OAS蛋白体外抗病毒机制奠定了基础。3.重组OAS1蛋白抗日本脑炎病毒的作用机制研究根据外源表达猪源OAS1蛋白在体外抗病毒谱和抗病毒最佳作用时机的分析,我们对其抗JEV作用机制展开了进一步讨论。利用猪源OAS1蛋白预处理细胞,通过控制病毒接种量和病毒接种细胞后的作用时间,分别在蛋白,基因和病毒滴度水平上检测猪源OAS1蛋白的抗病毒感染细胞的效果。结果表明：猪源OAS1蛋白能够有效发挥其抗病毒感染细胞的作用,主要是通过其抑制病毒在细胞内的复制,即使是在较高的蛋白浓度下(200μg/mL),猪源OAS1蛋白对病毒感染细胞的感作阶段几乎也没有影响,不影响病毒吸附细胞,不能有效控制病毒吸附细胞,阻止病毒入胞。蛋白预处理细胞,接毒后6h细胞内病毒的mRNA水平和滴度均略有降低。接毒后12h细胞培养的上清中病毒滴度有明显的降低,细胞内病毒的mRNA水平也显著有降低。蛋白处理组病毒蛋白含量与阳性对照相比显著下降。接毒后24h,猪源OAS1蛋白能够极显著抑制病毒在细胞内的复制。无论是细胞培养的上清中病毒滴度,还是细胞内病毒的mRNA水平都显著低于阳性对照组。蛋白处理组病毒蛋白含量与阳性对照相比亦有显著下降,而且当蛋白浓度为200μg/mL时,依然检测不到病毒蛋白的存在。猪源OAS1蛋白的D74和D76氨基酸残基是OAS/RNaseL途径主要的依赖性氨基酸残基,它们决定了RNaseL的催化活性。本研究通过Quick change PCR定点突变技术使猪源OAS1蛋白的D74和D76氨基酸残基发生改变,为研究猪源OAS1蛋白是否存在多个分子信号途径奠定了基础。结果表明,突变的猪源OAS1蛋白仍然具有抗病毒活性,在抗病毒感染的效力上,比亲本猪源OAS1蛋白略低,而且也是剂量依赖型的。由此看来,猪源OAS1蛋白在发挥抗病毒功能时存在多个分子信号途径。

全文目录

摘要  8-11
ABSTRACT  11-15
第一篇文献综述  15-45
  第一章 OAS抗病毒功能研究进展  15-25
    1 OAS家族的基因组成  15-17
      1.1 人类的OAS基因组成  15-16
      1.2 猪的OAS基因组成  16
      1.3 小鼠的OAS基因组成  16-17
    2 OAS蛋白的结构  17-18
    3 OAS的生物学功能以及催化作用机制研究  18-20
      3.1 OAS的生物学功能：OAS独特的2’聚合酶活性以及OAS蛋白的来源  19
      3.2 OAS的催化作用机制  19-20
    4 OAS蛋白家族抗病毒的分子机制研究进展  20-22
      4.1 OAS蛋白家族成员依赖于RNaseL途径的抗病毒作用  21
      4.2 OAS蛋白家族成员非依赖于RNaseL途径的抗病毒作用  21-22
    5 OAS蛋白与临床疾病的关系  22
    6 有关OAS蛋白研究的前景展望  22-25
  第二章日本乙型脑炎的研究背景  25-45
    1 日本乙型脑炎病毒的病原学特征及其理化特性  25-26
    2 日本乙型脑炎的流行以及流行的模式  26-28
    3 日本乙型脑炎病毒的扩散  28
    4 日本乙型脑炎的毒力影响因素和致病机理  28-30
      4.1 毒力影响因素  28-30
      4.2 致病机理  30
    5 流行性乙型脑炎病毒的生物合成  30-31
    6 流行性乙型脑炎疫苗的相关研究  31-32
    7 流行性乙型脑炎的诊断技术概况  32
    8 流行性乙型脑炎综合防治管理的有效措施  32-35
      8.1 积极宣传  33
      8.2 加强饲养管理措施  33
      8.3 加强预防措施  33
      8.4 免疫接种防治结合  33-34
      8.5 对症治疗措施  34
      8.6 加强监测  34-35
    9 流行性乙型脑炎疫苗的前景展望  35-36
    参考文献  36-45
第二篇实验部分  45-123
  第三章重组OAS1的可溶性表达与理化特性研究  45-65
    摘要  45-46
    1 实验材料  46-47
      1.1 材料  46
      1.2 实验动物  46
      1.3 主要试剂与工具酶  46-47
      1.4 主要仪器设备  47
    2 实验方法  47-57
      2.1 猪源OAS1基因的引物设计与合成  47
      2.2 提取PK-15细胞的总RNA  47-48
      2.3 猪源OAS1目的基因的RT-PCR扩增  48-49
      2.4 猪源OAS1目的基因原核表达载体的构建：连接及转化  49-54
      2.5 重组OAS1蛋白的可溶性诱导表达纯化  54-55
      2.6 重组OAS1蛋白的Western blot分析鉴定  55-56
      2.7 制备重组OAS1蛋白多克隆抗体并利用Western blot方法鉴定其反应原性  56-57
    3 实验结果  57-60
      3.1 猪源OAS1基因克隆与序列分析  57
      3.2 猪源OAS1原核表达重组质粒的构建  57-58
      3.3 猪源OAS1蛋白在大肠杆菌Rosetta2中的表达与纯化  58-60
      3.4 猪源OAS1蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体  60
    4 讨论  60-61
    参考文献  61-63
    ABSTRACT  63-65
  第四章重组OAS1蛋白抗病毒特性研究  65-91
    摘要  65-66
    1 实验材料  66-67
      1.1 细胞和毒株  66
      1.2 主要试剂  66-67
      1.3 主要仪器  67
    2 实验方法  67-77
      2.1 重组OAS1蛋白的脱盐处理,浓度测定以及其对细胞毒性的检测  67-69
      2.2 重组OAS1蛋白抗病毒谱的测定  69-76
      2.3 重组OAS1蛋白抑制病毒感染细胞的最佳时机分析  76-77
    3 实验结果  77-85
      3.1 重组OAS1蛋白的脱盐处理,浓度测定以及其对细胞毒性的检测  77-78
      3.2 重组OAS1蛋白抗病毒谱的测定  78-82
      3.3 重组OAS1蛋白抑制病毒感染细胞的最佳时机分析  82-85
    4 讨论  85-87
    参考文献  87-89
    Abstract  89-91
  第五章重组OAS1抗日本脑炎病毒的作用机制研究  91-123
    摘要  91-93
    1 实验材料  93-94
      1.1 细胞和毒株  93
      1.2 主要试剂  93
      1.3 主要仪器  93-94
    2 实验方法  94-101
      2.1 重组OAS1蛋白对JEV吸附和入胞的影响  94-96
      2.2 重组OAS1蛋白对JEV在细胞中早期增殖的影响  96-97
      2.3 重组OAS1蛋白在BHK-21细胞系上对JEV子代病毒感染效率的影响  97-98
      2.4 重组OAS1aD74A/D76A原核表达,纯化以及在BHK-21细胞系上抗JEV的活性测定  98-101
    3 实验结果  101-116
      3.1 重组OAS1蛋白对JEV吸附和入胞的影响  101-103
      3.2 重组OAS1蛋白对JEV在细胞中早期增殖的影响  103-106
      3.3 重组OAS1蛋白在BHK-21细胞系上对JEV子代病毒感染效率的影响  106-110
      3.4 重组OAS1aD74A/D76A原核表达,纯化以及在BHK-21细胞系上抗JEV的活性测定  110-116
    4 讨论  116-118
    参考文献  118-120
    ABSTRACT  120-123
全文总结  123-125
致谢  125

重组猪源OAS1抗日本脑炎病毒的特性研究

内容摘要

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