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我国部分地区猪圆环病毒2型的亚型鉴定和分离株增殖特性研究

作　者: 周忠涛
导　师: 何孔旺；姜平
学　校: 南京农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪圆环病毒2型 亚型鉴定 PK15细胞 Balb/c小鼠 增殖特性
分类号: S852.651
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)是圆环病毒科圆环病毒属成员,其病毒粒子无囊膜,基因组是由一条单股、负链、环状的DNA组成。PCV有PCV1和PCV2两个基因型,PCVl对猪是非致病性的,PCV2是引起猪圆环病毒相关疾病的主要病原,给世界养猪业带来了巨大的经济损失。PCV2主要分为五个亚型,即PCV2a、 PCV2b、PCV2c、PCV2d和PCV2e。本论文主要是对PCV2的亚型鉴定、PCV2的定量检测方法、PCV2a和PCV2b在PK15细胞上的增殖特性、PCV2a和PCV2b在Balb/c小鼠体内的增殖特性进行了研究。本文为PCV2的遗传变异、临床诊断和增殖特性的研究提供了一定的技术支持和理论基础。本论文主要内容如下：试验1.我国部分地区猪圆环病毒2型的亚型鉴定PCV2在我国各省市均有流行,为了了解2011至2012年间江苏、浙江和安徽三省部分猪场PCV2流行毒株的遗传变异情况,本研究利用PCV2检测引物从临床送检样品中筛选出28份阳性病料,利用两对PCV2全长扩增引物对阳性病料进行PCV2全长扩增和测序,然后对它们进行遗传进化分析。结果表明,全长序列为1767bp的有25个,为1768bp的有2个,为1766bp的有1个；28个毒株之间的核苷酸同源性为94.2%-100%,与13个参考毒株的核苷酸同源性为93.9%-100%；有3株为PCV2a,1株为PCV2b,24株为PCV2d,没有PCV2c和PCV2e.这表明当前主要的流行毒株是PCV2d。试验2.两种猪圆环病毒2型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用依据PCV2ORF1和ORF2基因的相对保守序列,分别设计合成两组特异性引物和TaqMan探针,构建分别包含PCV2ORF1和ORF2基因全长的重组质粒作为标准品,经过反应体系和反应条件的优化,绘制标准曲线,建立了两种检测PCV2的TaqMan实时荧光定量PCR方法。所建立的两条标准曲线的Ct值与起始模板拷贝数的对数之间具有良好的线性关系,相关系数R2均在0.99以上,扩增效率均在90%-110%之间；重复性好,组内变异系数均小于5%；特异性强；敏感性高,ORF1方法可达1.0×101copies/μL, ORF2方法可达1.0×102copies/μL。分别用两种方法对临床样品进行检测并比较检测结果。结果表明,由于一些临床样品中P1的存在,基于ORF1建立的定量检测方法更为准确、特异性更强,可用于PCV2的快速诊断和定量检测。试验3.猪圆环病毒2型两亚型分离株在PK15细胞上的增殖特性研究为了研究猪圆环病毒2型的两个主要亚型,即PCV2和PCV2b在体外的增殖特性,我们分别将本实验室分离的PCV2和PCV2b毒株接种PK15细胞进行连续传代,对两亚型毒株的体外增殖特性进行了研究。利用荧光定量PCR方法对各代次病毒含量进行定量检测,利用细胞免疫荧光方法对第10代、20代、30代、40代、50代、60代细胞毒进行TCIDso测定,比较两亚型毒株在体外的增殖特性。研究结果表明,随着传代次数的增加,两亚型病毒的感染滴度均有明显的提高,但是PCV2b的增殖速度要明显高于PCV2a的。试验4.猪圆环病毒2型两亚型分离株在Balb/c小鼠体内的增殖特性研究为了研究PCV2a和PCV2b两亚型毒株在Balb/c小鼠体内的增殖特性,本文将两亚型毒株分别接种Balb/c小鼠,利用荧光定量PCR, ELISA等方法对小鼠各脏器中的病毒含量、血清中病毒和抗体水平等指标进行了研究。结果表明,PCV2a和PCV2b两亚型毒株均能在小鼠体内增殖,不同的是,后者的增殖能力要更强一些。本文为深入研究PCV2两亚型的致病机理奠定了一定基础。

全文目录


目录  4-8
摘要  8-10
ABSTRACT  10-13
第一部分 文献综述  13-35
  第一章 猪圆环病毒研究进展  13-27
    1 PCV概况  13-14
    2 病原学  14-16
      2.1 病毒的理化特性  14-15
      2.2 PCV基因组结构及编码蛋白  15-16
    3 致病机理  16-17
    4 流行病学  17-18
    5 PCV2相关疾病  18-21
      5.1 断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)  18-19
      5.2 猪皮炎与肾病综合征(PDNS)  19
      5.3 猪呼吸道疾病综合征(PRDC)  19-20
      5.4 增生性坏死性间质性肺炎(PNP)  20
      5.5 繁殖障碍  20
      5.6 猪先天性震颤(CT)  20-21
    6 PCV2诊断方法  21-27
      6.1 病毒的分离与鉴定  21
      6.2 血清学方法  21-24
      6.3 分子生物学方法  24-27
  参考文献  27-35
第二部分 试验研究  35-87
  第一章 我国部分地区猪圆环病毒2型的亚型鉴定  35-47
    摘要  35
    1 材料和方法  35-38
      1.1 临床病料  35-36
      1.2 主要试剂  36
      1.3 引物设计与合成  36
      1.4 病料DNA的提取和阳性病料的筛选  36-37
      1.5 PCV2全基因序列的扩增和测序  37-38
      1.6 全基因序列的拼接和进化分析  38
    2 结果  38-43
      2.1 阳性病料的筛选  38
      2.2 PCV2全基因序列的扩增和测序  38-39
      2.3 PCV2全基因序列及遗传变异分析  39-40
      2.4 PCV2 ORF2及其编码的氨基酸序列的同源性比较  40-43
    3 讨论  43-45
    参考文献  45-46
    ABSTRACT  46-47
  第二章 两种猪圆环病毒2型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用  47-63
    摘要  47-48
    1 材料与方法  48-51
      1.1 菌株、毒株及病料  48
      1.2 主要试剂和仪器  48-49
      1.3 引物和探针的设计及合成  49
      1.4 重组质粒标准品的制备  49-50
      1.5 Real-time PCR检测方法的建立  50-51
      1.6 临床样品的检测  51
    2 结果与分析  51-58
      2.1 质粒标准品的制备  51-53
      2.2 Real-time PCR反应条件的优化  53
      2.3 Real-time PCR标准曲线的建立  53-55
      2.4 Real-time PCR的敏感性分析  55-56
      2.5 Real-time PCR的重复性分析  56-57
      2.6 Real-time PCR的特异性分析  57
      2.7 临床样品的检测  57-58
    3 讨论  58-60
    参考文献  60-62
    ABSTRACT  62-63
  第三章 猪圆环病毒2型两亚型分离株在PK15细胞上的增殖特性研究  63-73
    摘要  63
    1 材料和方法  63-65
      1.1 临床样品  63
      1.2 细胞  63
      1.3 主要试剂和培养基  63-64
      1.4 主要仪器  64
      1.5 阳性病料的筛选  64
      1.6 PCV2全基因序列的扩增、测序和基因分型  64
      1.7 PCV2两亚型的分离  64
      1.8 间接免疫荧光鉴定  64-65
      1.9 PCV2两亚型的体外增殖和TCID_(50)测定  65
      1.10 PCV2a和PCV2b在PK15细胞上的生长曲线  65
    2 结果  65-70
      2.1 接种临床病料的筛选  65-66
      2.2 PK15细胞的病变情况  66
      2.3 PCR检测  66-67
      2.4 间接免疫荧光鉴定  67-68
      2.5 PCV2全基因序列的扩增、测序和基因分型鉴定  68
      2.6 PCV2两亚型毒株不同代次细胞毒的TCID5o测定  68-69
      2.7 PCV2a和PCV2b在PK15细胞上的生长曲线  69-70
    3 讨论  70-71
    参考文献  71-72
    ABSTRACT  72-73
  第四章 猪圆环病毒2型两亚型分离株在Balb/c小鼠体内的增殖特性研究  73-87
    摘要  73
    1 材料和方法  73-76
      1.1 病毒  73
      1.2 实验动物  73
      1.3 主要的试剂和仪器  73-74
      1.4 试验设计  74
      1.5 体重称量  74
      1.6 血清的获取  74
      1.7 血清抗体水平检测  74-75
      1.8 血清病毒含量检测  75
      1.9 各脏器中病毒含量检测  75
      1.10 TaqMan实时荧光定量PCR  75-76
    2 结果与分析  76-81
      2.1 小鼠体重增长率的差异  76-77
      2.2 血清抗体水平检测  77-78
      2.3 血清病毒含量检测  78-79
      2.4 各脏器中病毒含量检测  79-81
    3 讨论  81-83
    参考文献  83-85
    ABSTRACT  85-87
全文总结  87-89
附录 常用试剂配制  89-93
致谢  93

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学 > 猪瘟病毒
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