学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

重组腺相关病毒介导的RNA干扰对乙型肝炎病毒复制和表达的影响

作　者: 付冰峰
导　师: 宁守斌
学　校: 河北北方学院
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: RNA干扰短发夹RNA rAAV HepG2.2.15细胞定点整合
分类号: R373.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 4次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染是一个非常严重的全球性的公共卫生问题,全世界约3.5亿人为慢性HBV感染者,每年全球大约有100万人死于与HBV感染相关的疾病,包括肝炎(Hepatitis)、肝硬化(Cirrhosis)、肝衰竭(Hepatic failure)和肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)。目前对HBV感染的主要治疗手段包括干扰素、核苷及核苷酸类似物等,但是这些药物只能在少数慢性感染患者中能产生长期应答,并不能彻底清除乙肝病毒,并且也存在着治疗后复发率高、药物毒副作用较大和药品价格昂贵等问题,因此,必须寻找更有效的治疗手段。RNA干扰技术(RNA interference,RNAi)即将与其目的基因同源的小分子双链(dsRNA)导入细胞内,导致目的mRNA降解,从而阻断真核细胞中相应基因产物的表达,它具有抑制效率高、特异性强、细胞较容易摄取等优点,成为一种新的分子生物学技术。但同时也存在作用时间短暂等不足。为解决这一问题,本实验采用腺相关病毒作为载体,利用它具有高稳定性、高靶向性、低致病性、低免疫原性、宿主范围广泛、可长期表达等优点,作为抗HBV的shRNA表达框的载体,转染含HBV病毒全基因组的HepG2.2.15细胞,观察对HBV复制和表达的抑制作用,尝试解决RNAi技术抗HBV作用时间短暂的问题。本研究将hu6驱动的shRNA表达框置于腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)的两个ITR(Inverted terminal repeat,ITR)之间,之后接有HBV的基本核心启动子(Bacic Core promoter, BCP)及其驱动AAV的Rep基因,由此构成rAAV,作为抗HBV的shRNA表达框的质粒载体,转染HepG2.2.15细胞(乙肝病毒基因插入肝细胞性肝癌细胞中),测定转染后细胞上清液中第1天、第2天、第3天及第10天HBsAg、HBeAg表达及HBV DNA拷贝数,并对细胞基因组AAVS1区域进行测序。经检测表明,成功构建了含目的序列的rAAV质粒载体PLRBR322-324、PLRBR522-324、PLRBR322-2424PLRBR522-2424。体外质粒转染细胞实验显示四个载体对HBsAg、 HBeAg表达及HBV DNA复制都有抑制效应,且前两者对HBsAg更高、后两者对HBeAg更高,第三个对HBV DNA拷贝数更高。转染后第3天后抑制效应最明显,第10天抑制率仍较高。针对细胞基因组AAVS1区域测序结果显示,目的序列定点整合于该区域。以上结果表明,利用AAV和HBV各种元件构建的rAAV,作为抗HBV的shRNA表达框的载体,借助Rep蛋白介导的定点整合作用,为解决RNAi抗HBV作用时间短暂的问题做了一些技术上的探索。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-9
英文缩写  9-10
前言  10-11
材料与方法  11-23
结果  23-24
附图  24-32
附表  32-34
讨论  34-38
结论  38-39
参考文献  39-43
综述  43-52
  参考文献  48-52
致谢  52-53
个人简历  53

重组腺相关病毒介导的RNA干扰对乙型肝炎病毒复制和表达的影响

内容摘要

全文目录

相似论文