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表达鸡传染性喉气管炎病毒gD、gE基因的重组马立克氏病毒构建

作　者: 刘怡
导　师: 吴艳涛
学　校: 扬州大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 传染性喉气管炎病毒马立克氏病毒同源重组保护效力
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

鸡传染性喉气管炎(infectious laryngotracheitis, LIT)是由传染性喉气管炎病毒(infectious laryngotracheitis virus, ILTV)所引起的急性呼吸道传染病。本病由于发病率高,减缓生长和引起产蛋下降等特点给养鸡业造成巨大经济损失。国内外的研究表明,目前使用的ILTV弱毒疫苗容易毒力返强,ILT的暴发大多与鸡胚源弱毒疫苗(CEO)的使用有关。因此,研制安全、有效的新型疫苗对于ILT的防控具有重要意义。本研究以ILTV Anhui-2011-2株DNA为模板,采用PCR扩增ILTV gD、gE基因；利用马立克氏病毒(MDV)CVI988/Rispens疫苗株基因组IRS-US连接区同源序列、网状内皮增生症病毒的长末端重复序列(LTR)启动子、绿色荧光蛋白(EGFP)基因,构建含gD、gE基因的转移载体质粒pLTR-EGFP-gD和pLTR-EGFP-gE。以磷酸钙沉淀法将转移载体质粒和MDV CVI988/Rispens基因组DNA共同转染鸡胚成纤维细胞(CEF),通过筛选、纯化得到带EGFP标志的重组病毒rMDV-EGFP-gD和rMDV-EGFP-gE。利用Cre重组酶去除rMDV-EGFP-gD和rMDV-EGFP-gE基因组中EGFP基因,重新转染CEF细胞,经筛选、纯化得到不含EGFP基因的重组病毒rMDV-gD和rMDV-gE。经Western blot分析,重组病毒rMDV-gD和rMDV-gE可分别表达ILTV gD蛋白和gE蛋白。本研究评价了1日龄SPF鸡接种重组病毒rMDV-gD和rMDV-gE后对ILTV Anhui-2011-2株及MDV RB1B强毒株的免疫保护效力。其中,重组病毒对ILT的免疫保护试验设立rMDV-gD免疫组、rMDV-gE免疫组、ILT CEO疫苗免疫组、非免疫攻毒对照组和健康对照组,从发病率、死亡率、临床症状、病理组织学变化、对增重的影响和抗体水平等方面评价免疫效力。rMDV-gD免疫组在ILTV攻毒后的发病率(35%)和死亡率(5%)与非免疫攻毒对照组(发病率100%,死亡率36.8%)存在显著差异(p<0.05)；rMDV-gE免疫组的死亡率(19%)与非免疫攻毒对照组差异不显著(p>0.05)。攻毒前后(42日龄-52日龄)各免疫组增重差异不显著(p>0.05),但CEO疫苗组增重最小(0.113kg)。间接ELISA检测各免疫组攻毒前后的血清抗体效价,结果显示抗体效价的高低与保护效力之间没有相关性。经病理组织学检查,攻毒后rMDV-gD免疫组的气管和肺脏显微病变较ILT CEO疫苗免疫组和rMDV-gE免疫组轻微。在重组病毒对MD的免疫保护试验中,rMDV-gD免疫组和rMDV-gE免疫组对MDV RBIB强毒株攻击能够提供完全保护,与MDV CVI988/Rispens免疫组的效果相当。综上所述,本研究构建的重组病毒rMDV-gD是较理想的LIT新型疫苗候选毒株。

全文目录

中文摘要  3-5
Abstract  5-8
符号说明  8-10
第一章文献综述传染性喉气管炎研究进展  10-19
  1. 流行病学研究  10-11
  2. 病原学研究  11-16
    2.1 病毒基因组结构  12-13
    2.2 病毒的转录和复制  13-14
    2.3 病毒主要功能蛋白特性  14-16
  3. 疫苗研究  16-19
第二章表达鸡传染性喉气管炎病毒gD、gE基因的重组马立克氏病毒构建  19-49
  1 材料  20-21
    1.1 毒株、菌株和质粒  20
    1.2 鸡胚和实验动物  20
    1.3 主要试剂  20-21
    1.4 主要仪器  21
  2 方法  21-30
    2.1 ILTV gD和gE基因的原核表达及其抗血清的制备  21-23
    2.2 转移载体的构建  23-27
    2.3 重组病毒的构建  27-28
    2.4 重组病毒免疫效力试验  28-30
  3 结果  30-45
    3.1 ILTV gD和gE基因原核表达及其抗血清的制备  30-34
    3.2 转移载体的构建和鉴定  34-36
    3.3 重组病毒的构建和鉴定  36-38
    3.4 重组病毒免疫效力试验  38-45
  4 讨论  45-49
参考文献  49-57
致谢  57-58

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