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幼鼠精原干细胞体外培养及诱导分化的研究

作　者: 王鹏
导　师: 胡建宏
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 动物学
关键词: 幼鼠精原干细胞体外培养诱导分化
分类号: Q813.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

精原干细胞(spermatogonial stem cells, SSCs)是哺乳动物体内唯一可将遗传信息传递给子代的二倍体体细胞,对于其体外增殖及其诱导分化的研究不仅可为哺乳动物遗传信息的保存提供技术支持,也可为哺乳动物精子发生的研究提供重要的理论依据。恩研究通过从幼鼠(6～8d)睾丸分离纯化精原干细胞样细胞,用维甲酸(retinol acid, RA)诱导其分化为单倍体生殖细胞。通过两步酶消化法和差异贴壁法分离纯化精原干细胞样细胞,用M1培养基培养3d后出现细胞集落。用碱性磷酸酶染色、反转录PCR法和间接免疫细胞化学法鉴定后,细胞集落为SSCs。随后,用含有RA的M2培养基培养精原干细胞集落2d后,将其在用M1培养基培养6～8d。用反转录PCR法和间接免疫细胞化学法鉴定单倍体生殖细胞。主要结果如下：1.SSCs是一类较小的细胞且较为均一的圆形或椭圆形细胞。通过差速贴壁法分离纯化后获得了纯度较高的目的SSCs,待接种到经丝裂霉素C处理过后的Sertoli cells上后,第二天开始分裂增殖。用含有EGF的培养基培养3d后细胞集落较小,5～7d后细胞集落明显。SSCs集落成辐射状生长,细胞形态较小、均一且为椭圆形,符合SSCs的形态特征。2.SSCs与Sertoli cells的形态特征具有显著的差别。SSCs一般为圆形或是椭圆形,并能被AKP染色成蓝紫色或棕色且细胞较小。但Sertoli cells细胞较大,体外培养多为不规则形状且不能被AKP染色成蓝紫色或是棕色。Ngn3基因是SSCs典型表达的基因；Oct4基因的表达可维持干细胞的多潜能性和自我更新；Integrin alpha6和Integrin beta I为SSCs表达的细胞表面标记分子。β-actin是SSCs和Sertoli cells的管家基因。SSCs表达Oct4, Integrin alpha6, Integrin beta1,Ngn3和管家基因(β-actin),而Sertoli cells只表达β-actin基因；通常,As (a single)和Apr (a paired)精原细胞被认定为具有干细胞特性的生殖细胞。CD9作为鉴定精原干细胞的表面分子标记。本试验结果表明,SSCs集落在培养3～5d后表达CD9,Sertoli cells也可表达CD9。虽然Sertoli cells也表达CD9,但其形态与SSCs显著不同。Sertoli cells细胞核较小,细胞质所占比例较大；而SSCs细胞核较大,细胞质所占比例较小3.待所培养的SSCs出现明显的集落后,加入RA诱导2d,然后继续在无RA的基础培养基中培养5～8d,SSCs进入减数分离后期并表达Sycp3和TH2B。RA可诱导SSCs进入减数分离。鱼精蛋白(protamine1)为细胞减数分裂后期大量表达,是单倍体生殖细胞的一个分子标记。RA诱导SSCs后,在无RA培养基中培养8d后,检测发现单倍体生殖细胞大量表达protamine1。

全文目录

摘要  6-7
ABSTRACT  7-11
第一章精原干细胞的研究进展  11-16
  1.1 SSCs群的起源  11-12
  1.2 SSCs的微生境  12-13
  1.3 SSCs的调控和精原细胞的功能  13
  1.4 鼠SSCs的分离纯化  13-14
  1.5 鼠SSCs的体外培养  14
  1.6 鼠SSCs的诱导分化研究  14-15
  1.7 本研究的目的和意义  15-16
第二章幼鼠精原干细胞体外增殖培养的研究  16-21
  前言  16
  2.1 材料和方法  16-17
    2.1.1 材料  16-17
    2.1.2 方法  17
  2.2 结果与分析  17-19
    2.2.1 睾丸单细胞悬液  17
    2.2.2 小鼠SSCs的分离纯化  17-18
    2.2.3 小鼠SSCs集落  18-19
  2.3 讨论  19-20
  2.4 小结  20-21
第三章幼鼠精原干细胞的鉴定  21-28
  前言  21
  3.1 材料和方法  21-23
    3.1.1 材料  21-22
    3.1.2 方法  22-23
  3.2 结果与分析  23-25
    3.2.1 AKP鉴定SSCs  23-24
    3.2.2 RT-PCR鉴定SSCs  24
    3.2.3 免疫细胞化学鉴定SSCs  24-25
  3.3 讨论  25-26
  3.4 小结  26-28
第四章幼鼠精原干细胞的体外诱导分化及鉴定  28-33
  前言  28
  4.1 材料和方法  28-30
    4.1.1 材料  28-29
    4.1.2 方法  29-30
  4.2 结果与分析  30-31
    4.2.1 RT-PCR鉴定单倍体生殖细胞  30
    4.2.2 免疫细胞化学鉴定单倍体生殖细胞  30-31
  4.3 讨论  31-32
  4.4 小结  32-33
结论  33
进一步研究内容  33-34
参考文献  34-42
附录Ⅰ 主要溶液的配制  42-43
附录Ⅱ 小鼠睾丸单细胞悬液的制备  43-44
附录Ⅲ RT-PCR  44-46
缩略词  46-47
致谢  47-48
作者简介  48

幼鼠精原干细胞体外培养及诱导分化的研究

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