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AtMYB2转录因子的原核表达及与S/CMO基因启动子相互作用分析

作　者: 于连
导　师: 李秋莉
学　校: 辽宁师范大学
专　业: 细胞生物学
关键词: AtMYB2转录因子 CMO基因启动子 原核表达 凝胶阻滞分析
分类号: Q943
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


AtMYB2转录因子属于MYB家族蛋白,它的表达受ABA、脱水和盐诱导,它能与TGGTTAG(反向互补序列为CTAACCA)序列结合,促进下游基因的表达。胆碱单加氧酶(CMO)是植物体内催化胆碱合成甜菜碱第一步反应过程中的关键酶,它的表达是受盐诱导的。辽宁碱蓬CMO基因启动子-267-+lbp区段(命名为pC5)是盐诱导启动子,其序列上含有AtMYB2转录因子的识别位点TAACCA。在AtMYB2/CMO-pC5双价转基因烟草体内,AtMYB2转录因子能使转基因烟草中GUS活性增加,AtMYB2转录因子在体内能与CMO启动子相互作用。本实验用原核表达的方法,纯化得到AtMYB2融合蛋白,通过EMSA实验,验证在体外AtMYB2转录因子能否与CMO基因启动子直接结合,从而分析AtMYB2转录因子对CMO基因表达的调控作用。主要内容与结果如下：1、构建了原核表达载体pET30a-AtMYB2,并将其转化到E.BL21(DE3)菌株中,获得工程菌E.BL21-pET30a-AtMYB2。2、AtMYB2融合蛋白可在大肠杆菌中高效表达,融合蛋白既以可溶蛋白形式存在,也以包涵体形式存在。通过从IPTG浓度、诱导温度、诱导时间三方面因素优化了AtMYB2融合蛋白可溶表达的最佳条件,确定了以0.1mM IPTG诱导,30℃培养10h,可溶蛋白表达量最高。3、利用Ni2+亲和纯化了AtMYB2可溶蛋白和6×His载体蛋白。4、通过凝胶阻滞分析实验验证AtMYB2蛋白与CMO基因启动子之间的相互作用,结果表明,AtMYB2转录因子能与SICMO启动子中TAACCA序列直接结合。进一步证明AtMYB2可能是调控CMO基因表达的一个转录因子

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-9
1 文献综述  9-19
  1.1 原核表达系统  9-15
    1.1.1 表达载体  9-12
    1.1.2 目的蛋白在细胞中的定位  12
    1.1.3 目的蛋白在细胞中的表达形式  12-14
    1.1.4 重组蛋白的纯化  14-15
    1.1.5 原核表达系统的特点  15
  1.2 MYB2转录因子  15-17
    1.2.1 MYB2蛋白的结构  15-16
    1.2.2 MYB2转录因子的识别位点  16
    1.2.3 MYB2转录因子的功能  16-17
  1.3 CMO启动子  17
  1.4 本研究的目的及意义  17-19
2 AtMYB2蛋白的原核表达  19-41
  2.1 实验材料  19-20
    2.1.1 质粒和菌株  19
    2.1.2 试剂  19
    2.1.3 PCR引物  19
    2.1.4 培养基  19
    2.1.5 主要仪器  19-20
  2.2 实验方法  20-29
    2.2.1 AtMYB2原核表达载体的构建  20-24
    2.2.2 工程菌的构建  24-25
    2.2.3 融合蛋白的诱导表达  25
    2.2.4 表达蛋白的分离与检测  25-27
    2.2.5 AtMYB2可溶蛋白表达条件优化  27-28
    2.2.6 AtMYB2可溶蛋白的纯化  28-29
  2.3 结果与分析  29-39
    2.3.1 AtMYB2原核表达载体的构建  29-32
    2.3.2 工程菌的构建  32-33
    2.3.3 AtMYB2蛋白的表达及表达形式分析  33-34
    2.3.4 AtMYB2可溶蛋白表达条件优化  34-37
    2.3.5 可溶蛋白的纯化  37-39
  2.4 讨论  39-40
    2.4.1 可溶蛋白表达条件的优化  39-40
    2.4.2 可溶蛋白的亲和纯化  40
  2.5 小结  40-41
3 AtMYB2转录因子与SICMO启动子功能元件相互作用分析  41-48
  3.1 实验材料  41
    3.1.1 试剂  41
    3.1.2 主要仪器  41
  3.2 实验方法  41-44
    3.2.1 探针制备  41
    3.2.2 凝胶阻滞分析实验  41-44
  3.3 结果与分析  44-46
    3.3.1 探针制备  44-45
    3.3.2 凝胶阻滞分析实验  45-46
  3.4 讨论  46-47
  3.5 小结  47-48
4 结论  48-49
参考文献  49-53
附录A pET-30a(+)载体图谱  53-54
附录B DL2000 DNA Marker  54-55
附录C λ-HindⅢ DNA Marker  55-56
附录D 蛋白分子量标准(低)  56-57
附录E LB培养基配方  57-58
附录F pC5启动子序列  58-59
攻读硕士学位期间发表学术论文情况  59-60
致谢  60

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中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物细胞遗传学
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