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镇痛抗肿瘤肽AGAP对人脑胶质瘤细胞SHG-44增殖和迁移的抑制作用

作　者: 赵有龙
导　师: 张双全；曹鹏
学　校: 南京师范大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 镇痛抗肿瘤肽(AGAP) 人恶性神经胶质瘤细胞(SHG-44) 增殖 细胞周期 迁移
分类号: R285
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 34次
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内容摘要


恶性神经胶质瘤是原发性脑肿瘤中最常见的亚型,其具有高度增殖侵袭迁移能力和极大的神经破坏性的特点,被认为是最致命的人类癌症。虽然治疗恶性神经胶质瘤疾病的方法和技术都在不断地改进,但是这种病人治愈的期望值很小。在中国的传统中医中,东亚钳蝎自宋代以来就已经成为治疗多种疾病必不可少的药物。蝎毒素中含有多种具有不同功能的活性多肽。镇痛抗肿瘤肽AGAP是其中的一种,现已证明其具有明显的抗肿瘤活性。在本实验中,我们用MTT法、流式细胞周期检测和单层伤口愈合实验分别检测了rAGAP对神经胶质瘤细胞系SHG-44增殖、细胞周期和细胞迁移的影响,实验结果显示,重组蛋白rAGAP不仅可以抑制人神经胶质瘤细胞SHG-44和大鼠神经胶质瘤细胞C6的增殖,而且阻断SHG-44细胞周期G1期,并抑制单层伤口愈合实验中SHG-44细胞的迁移。为了解释这些现象,我们进一步研究其作用的机制。本实验分别用western blot、RT-PCR和明胶酶谱分析方法测定了SHG-44细胞中mRNA和蛋白表达量的变化,来研究其抑制SHG-44细胞迁移的作用机制。结果发现：rAGAP可以通过下调p-AKT蛋白的活性来抑制细胞周期调控蛋白CDK2和CDK6的表达,进而抑制RB的磷酸化,阻滞了SHG-44细胞周期G1期向S期的转化。另外,通过研究与细胞增殖迁移相关的信号通路,我们发现rAGAP减少了p-p38, p-c-Jun和p-Erkl/2的活化,下调NF-κB和BCL-2蛋白的表达,从而降低其下游调控目的蛋白VEGF和MMP-9的活性,最终抑制SHG-44细胞的迁移。总之,rAGAP通过阻滞细胞周期G1期和下调Erk1/2的活性来抑制SHG-44细胞增殖,并通过干扰p-AKT, NF-κB, BCL-2和MAPK信号通路蛋白的表达抑制SHG-44的细胞迁移。

全文目录


摘要  3-5
ABSTRACT  5-7
英文缩写说明  7-10
第一章 文献综述  10-16
  1. SHG-44(human malignant glioma cells)  10-12
    1.1 恶性神经胶质瘤的治疗现状  10-11
    1.2 治疗恶性神经胶质瘤的靶点  11-12
  2. AGAP(analgesic antitumoral peptide)  12-16
    2.1 蝎毒素简介  12-13
    2.2 蝎毒素抗肿瘤研究进展  13-14
    2.3 蝎毒素抗肿瘤的作用机制  14
    2.4 AGAP简介  14-16
第二章 重组蛋白rAGAP的制备  16-29
  1. 实验材料  16-18
    1.1 主要仪器设备  16
    1.2 实验材料和试剂  16-17
    1.3 菌种和质粒  17
    1.4 主要溶液的配制  17-18
  2. 实验方法  18-24
    2.1 pET29a-AGAP融合载体的构建  18-21
    2.2 pET29a-AGAP在大肠杆菌中的表达  21-22
    2.3 Western blot鉴定  22-24
  3. 实验结果  24-27
    3.1 rAGAP表达载体的构建  24-25
    3.2 rAGAP蛋白的纯化  25-26
    3.3 western blot鉴定rAGAP蛋白  26-27
  4. 讨论  27-29
第三章 rAGAP对神经胶质瘤细胞SHG-44增殖迁移的影响及其机制的探索  29-52
  1. 实验材料  29-31
    1.1 细胞系  29
    1.2 主要实验仪器  29-30
    1.3 抗体  30
    1.4 主要试剂配制  30-31
  2. 实验方法  31-40
    2.1 细胞培养、冻存与复苏  31-32
    2.2 细胞的传代培养  32
    2.3 MTT法测定重组蛋白rAGAP对SHG-44和C6胶质瘤细胞的增殖抑制率  32-33
    2.4 流式细胞仪检测rAGAP对SHG-44胶质瘤细胞周期的影响  33
    2.5 用单层伤口愈合实验检测rAGAP对SHG-44胶质瘤细胞迁移的影响  33-34
    2.6 用western blot从蛋白水平研究rAGAP阻滞SHG-44细胞周期和抑制细胞迁移的作用机制  34-36
    2.7 用RT-PCR从mRNA水平研究rAGAP阻滞SHG-44细胞周期和抑制细胞迁移的作用机制  36-39
    2.8 明胶酶谱实验  39-40
    2.9 统计学方法  40
  4. 实验结果  40-46
    4.1 不同浓度的rAGAP对SHG-44胶质瘤细胞增殖活性的影响  40-41
    4.2 流式细胞仪检测rAGAP对SHG-44神经胶质瘤细胞周期的阻滞  41-42
    4.3 rAGAP对SHG-44细胞迁移的抑制  42-43
    4.4 western blot检测rAGAP对SHG-44细胞周期蛋白表达量的影响  43-44
    4.5 Western blot检测rAGAP对SHG-44细胞增殖迁移相关信号通路蛋白表达量的影响  44-45
    4.6 rAGAP对SHG-44细胞增殖迁移相关基因的影响  45
    4.7 明胶酶谱分析  45-46
  5. 讨论  46-52
    5.1 MTT检测rAGAP对SHG-44胶质瘤细胞毒性  46-47
    5.2 rAGAP对SHG-44胶质瘤细胞周期的影响  47-48
    5.3 rAGAP对SHG-44胶质瘤细胞迁移的影响  48-52
参考文献  52-59
附录:在读期间发表的学术论文及研究成果  59-60
致谢  60

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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 中药药理学
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