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四川省食品动物源性大肠杆菌耐药性监测及整合子—基因盒检测

作　者: 陈雅莉
导　师: 林居纯
学　校: 四川农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 食品动物源大肠杆菌耐药性整合子-基因盒检测
分类号: S852.61
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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引　用: 2次
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内容摘要

伴随着抗菌药物在兽医临床的广泛使用,耐药菌株迅速出现,多重耐药现象十分普遍,已经引起全世界的广泛关注。做好耐药性监测,从而指导兽医临床合理用药已刻不容缓。对于细菌耐药性检测,传统的方法主要是进行耐药表型监测,随着分子生物技术的发展,PCR技术在耐药基因型的检测及新耐药机制的发现方面发挥着重要的作用。本研究首先从四川省不同养殖场收集食品动物源大肠杆菌病样本,按常规的细菌分离鉴定方法进行大肠杆菌菌株的鉴定。按照CLSI推荐方法及结果判断标准,应用微量肉汤稀释法测定细菌对于不同抗菌药物的最小抑菌浓度(MIC),从而对四川省食品动物源大肠杆菌的耐药情况进行监测。对于多重耐药菌株,采用多重PCR技术对其携带的3类整合子进行检测,同时对整合子阳性菌株进行基因盒分析。本次研究分2部分完成。1.不同食品动物源性大肠杆菌耐药性的监测从四川不同地区规模较大的养殖场收集食品动物源(鸡源、鸭源、牛源、猪源)大肠杆菌病样本,分离鉴定出705株大肠杆菌。采用微量肉汤稀释法进行了25种抗菌药物的药敏实验。结果显示：705株大肠杆菌对25种抗菌药物表现出程度不同的耐药性,特别是对兽医临床长期使用的甲氧苄啶、复方新诺明、利福平的耐药率接近100%；其次是对氨苄西林、四环素、氯霉素、氟喹诺酮类药物的耐药率均超过了70%；对头孢唑啉、头孢噻呋、头孢曲松也表现出一定的耐药性,耐药率分别为34.34%、41.30%、26.25%,但中介率较高,可见大肠杆菌对β-内酰胺类药物存在耐药率上升的趋势；本次监测发现所有大肠杆菌只有对阿米卡星保持有一定的敏感性,敏感率超过67%。多重耐药性分析显示,705株菌均为多重耐药菌株,主要表现出15-24耐,在各种耐药谱型中,23耐菌株所占比率最大,其次为21耐。不同动物源菌株耐药性比较显示,禽源菌株的耐药情况较猪源菌株,牛源菌株严重。不同地区来源菌株耐药性比较可见,不同地区来源菌株对所检测的25种药物耐药性分布大体一致,对部分药物表现出一定地域差异。2.食品动物源性大肠杆菌的整合子—基因盒检测采用多重PCR方法同时扩增327株大肠杆菌整合酶Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型基因。多重PCR检测结果显示,在32Ⅳ株菌株中,294株细菌携带有Ⅰ型整合酶基因,其检出率为89.91%,本次检测未发现携带有Ⅱ型和Ⅲ型整合酶基因的菌株。随机抽取Ⅰ型整合酶阳性菌株81株,进行基因盒扩增,扩增结果显示14株Ⅰ型整合酶阳性菌株未扩增出基因盒片段,其余67株扩增出845bp-2731bp的基因盒片段。测序结果显示,67株菌中含有6种不同类型的基因盒,即dfrA17+aadA5、dfrA17、aadA22、dhfrAI+ aadA2、dfrA17+orfF+aadA2、aacA4+catB3+dfrA1,编码甲氧苄啶-磺胺类药物、氨基糖苷类药物和氯霉素耐药。本次研究发现在2株鸡源大肠杆菌株中,发现了通过整合子-基因盒携带的一种介导氨基糖苷类药物耐药的新基因aadA22,这是首次在四川分离菌株中发现该基因的存在,其介导的耐药性有待进一步的研究。

全文目录

摘要  3-5
ABSTRACT  5-10
概述  10-20
  1. 埃希氏大肠杆菌概述及耐药现状  10-12
    1.1 埃希氏大肠杆菌概述  10-11
    1.2 埃希氏大肠杆菌耐药现状  11-12
  2. 细菌的耐药机理  12-20
    2.1 细菌耐药的生化机制  12-14
      2.1.1 产生酶使药物灭活  12-13
      2.1.2 改变细菌细胞膜对药物的通透性  13
      2.1.3 抗生素作用靶位的改变  13
      2.1.4 细菌主动外排机制  13-14
      2.1.5 改变药物的代谢途径  14
    2.2 细菌耐药的遗传机制  14-20
      2.2.1 细菌自身基因突变造成耐药  14
      2.2.2 细菌获得外源基因产生耐药  14-20
第一章致病性大肠杆菌对常用抗菌药物的耐药性监测  20-57
  1 材料与方法  20-23
    1.1 材料  20-22
      1.1.1 大肠杆菌样本及来源  20
      1.1.2 标准菌株  20
      1.1.3 抗菌药物  20-21
      1.1.4 培养基、细菌生化鉴定管及其他试剂  21
      1.1.5 主要仪器与设备  21-22
    1.2 方法  22-23
      1.2.1 样品采集  22
      1.2.2 细菌分离、鉴定与保存  22
      1.2.3 抗菌药物敏感性实验  22-23
  2. 结果  23-53
    2.1 食品动物源大肠杆菌的分离和鉴定  23
    2.2 微量稀释法药敏盒的制备  23-24
    2.3 细菌对25种抗菌药物的药敏实验结果  24-28
      2.3.1 猪源大肠杆菌对25种抗菌药物的MIC值  24-25
      2.3.2 牛源大肠杆菌对25种抗菌药物的MIC值  25-26
      2.3.3 鸭源大肠杆菌对25种抗菌药物的MIC值  26-27
      2.3.4 鸡源大肠杆菌对25种抗菌药物的MIC值  27-28
    2.4 食品动物源大肠杆菌对25种抗菌药物的耐药率与分析  28-34
      2.4.1 不同食品动物源大肠杆菌对25种抗菌药物的耐药率与分析  28-30
      2.4.2 不同地区食品动物源大肠杆菌对25种抗菌药物的耐药率与分析  30-34
    2.5 2005年-2009年食品动物源大肠杆菌对7大类抗菌药物的耐药趋势  34-40
      2.5.1 对β-内酰胺类抗菌药物的耐药趋势  34-35
      2.5.2 对氨基糖苷类药物的耐药趋势  35
      2.5.3 对四环素类的耐药趋势  35-36
      2.5.4 对氯霉素类药物的耐药趋势  36-37
      2.5.5 对磺胺类抗菌药物的耐药趋势  37-38
      2.5.6 对氟喹诺酮类的耐药趋势  38-39
      2.5.7 对其他常用抗生素的耐药趋势  39-40
    2.6 食品动物源大肠杆菌对25种常用抗菌药物的耐药谱及分析  40-53
  3. 讨论  53-57
    3.1 抗菌药物敏感性试验方法-微量肉汤稀释法  53-54
    3.2 2005年-2009食品动物源大肠耐药情况  54-55
    3.3 合理使用抗生素  55-57
第二章食品动物源大肠杆菌整合子—基因盒的检测  57-101
  1 材料和方法  58-64
    1.1 材料  58-59
      1.1.1 菌株  58
      1.1.2 试剂  58-59
      1.1.3 主要设备及仪器  59
    1.2 方法  59-64
      1.2.1 样品采集,菌株分离鉴定  59
      1.2.2 菌株对不同药物的MIC值测定  59
      1.2.3 多重PCR检测三类整合子  59-61
      1.2.4 整合子整合酶基因测序  61
      1.2.5 Ⅰ型整合子阳性菌株基因盒的检测及鉴定  61-64
  2. 结果  64-97
    2.1 多重PCR扩增不同类型整合子整合酶基因  64-66
    2.2 Ⅰ型整合酶基因检测  66-67
    2.3 Ⅰ型整合子—基因盒检测及测序  67-86
      2.3.1 Ⅰ型整合子—基因盒PCR扩增结果  67-68
      2.3.2 基因盒的克隆测序及比对  68-86
    2.4 食品动物源大肠杆菌Ⅰ型整合子各类基因盒检出情况  86-87
    2.5 67株大肠杆菌多重耐药性与耐药基因盒关系  87-91
    2.6 大肠杆菌的六类Ⅰ整合子模式图  91-93
    2.7 aadA22基因与aadA基因家族的其他基因型的同源性分析  93-97
  3. 讨论  97-101
    3.1 多重PCR技术检测整合子整合酶基因  97-98
    3.2 intI1型的检测  98
    3.3 Ⅰ型整合子阳性菌株基因盒的检测  98-99
    3.4 81株大肠杆菌的耐药表型与基因盒检测  99
    3.5 四川地区大肠杆菌分离菌株中首次发现耐药基因—aadA22  99-101
参考文献  101-105
致谢  105-106
附录一  106

四川省食品动物源性大肠杆菌耐药性监测及整合子—基因盒检测

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