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畜禽肠道大肠杆菌耐药性及整合子—基因盒检测

作　者: 张辉建
导　师: 林居纯
学　校: 四川农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 大肠杆菌耐药性整合子-基因盒检测
分类号: S852.61
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

随着抗菌药物在畜牧养殖业中的大量使用,细菌出现了严重的耐药性,且多重耐药现象十分普遍,引起了全世界的广泛关注。大肠杆菌作为畜禽肠道重要的栖居菌,承受着各种药物的选择压力,成为了多重耐药基因的储库,对其进行耐药性检测,可以了解耐药性的流行规律,预测耐药性的发展趋势,为评估抗菌药物使用风险,以及临床合理使用抗菌药物提供科学依据。本次研究从四川省不同养殖场及食品零售店,采集健康畜禽肛拭子和肠道内容物,分离鉴定出914株大肠杆菌。依据CLSI推荐方法及结果判断标准,采用微量肉汤稀释法进行了914株菌对25种抗菌药物的耐药性检测。耐药性检测显示,914株大肠杆菌对25种抗菌药物的耐药情况十分严重(耐药率在12%～98%),其中对利福平、甲氧苄啶和复方新诺明的耐药率高达98%以上；对氨苄西林、阿莫西林和克拉维酸、链霉素、四环素、多西环素、氟苯尼考、萘啶酸等耐药率超过70%,对头孢曲松、头孢噻呋和阿米卡星相对敏感,耐药率不及30%。99.8%的菌株呈多重耐药性,多重耐药菌株主要表现为12～25耐。不同动物源菌株耐药性比较发现,鸭源株对头孢唑啉、头孢噻呋、阿莫西林+克拉维酸、氟苯尼考、利福平、甲氧苄啶、复方新诺明耐药率最高,其次为鸡源菌,猪源菌耐药率最低；鸡源株对达氟沙星耐药率最高；其余17种药物的耐药率均以猪源株最高,鸡源和鸭源耐药率接近。914株大肠杆菌中随机选取455株菌,采用多重PCR方法同时扩增其整合酶Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型基因。多重PCR检测结果显示,猪源菌株Ⅰ型整合子携带率为92.95%,鸡源菌株为86.55%,鸭源菌株为85.55%；Ⅱ型整合子检测发现,4株猪源菌和5株鸡源菌同时检测出Ⅰ型整合子和Ⅱ型整合子；本次未检测出Ⅲ型整合子。随机抽取204株Ⅰ型整合子阳性菌株,对其耐药基因盒可变区进行PCR扩增发现,猪源、鸡源、鸭源菌株基因盒检出率分别为88.73%、83.95%和82.69%。采用DNA测序及RFLP方法,共检测出8种不同类型的基因盒。最常见的扩增片段为1572bp,其基因盒分子特征为dfrAl-aadAl,其余基因盒片段在751～2731bp分布,分别是dfrA27、dfrA17 aadA22、dfrAl-orfC、dfrA17-aadA5、dfrA12-orfF-aadA2和aacA4-catB3-dfrA1。对Ⅱ型整合子阳性菌基因盒检测发现,9株菌共检测3种类型的基因盒,片段大小在1276～2509bp分布,分别为dfra1-sat2、dfrA1-sat2、aadA1和estX-sat2-aadA1。本次对四川省不同地区畜禽肠道栖居大肠杆菌耐药性及整合子—基因盒检测发现,不同畜禽大肠杆菌对25种抗菌药物耐药性非常严重,多重耐药菌株流行。耐药菌株中普遍携带Ⅰ型整合子,整合子—基因盒分子特征以dfrA1-aadA1为主。菌株耐药表型与其携带整合子有相关性。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-8
缩略词表  8-11
第一章文献综述及目的意义  11-21
  1 文献综述  11-20
    1.1 大肠埃希氏菌概述  11-12
    1.2 大肠埃希氏菌耐药现状  12
    1.3 耐药性产生的机制  12-15
    1.4 整合子—基因盒系统与细菌耐药性的关系  15-20
  2 研究的目的意义  20-21
第二章四川省健康畜禽肠道大肠杆菌的耐药性检测  21-34
  1 材料与方法  21-24
    1.1 材料  21-23
    1.2 方法  23-24
  2. 结果与分析  24-32
    2.1 大肠杆菌的分离和鉴定  24
    2.2 微量稀释法药敏盒的制备  24
    2.3 健康动物源大肠杆菌对25种抗菌药物的药敏实验结果及分析  24-25
    2.4 914株大肠杆菌对25种抗菌药物的耐药性  25-28
    2.5 不同动物源分离菌株对25种抗菌药物耐药情况比较  28-30
    2.6 914株大肠杆菌对25种常用抗菌药物的多重耐药率性  30-32
  3. 讨论  32-34
    3.1 四川地区不同动物源大肠杆菌对25种抗菌药物的耐药情况  32-33
    3.2 合理使用抗生素  33-34
第三章健康动物肠道大肠杆菌整合子—基因盒的检测  34-64
  1 材料和方法  34-42
    1.1 材料  34-36
    1.2 方法  36-42
  2 结果与分析  42-59
    2.1 健康动物源大肠杆菌整合子整合酶基因的检测结果及分析比较  42-44
    2.2 不同动物源大肠杆菌整合子—基因盒可变区PCR扩增结果及整合子流行种类  44-48
    2.3 不同动物源大肠杆菌整合子—基因盒可变区的克隆测序及酶切图谱分析  48-50
    2.4 不同动物源大肠杆菌Ⅰ、Ⅱ型整合子各类基因盒检出情况  50-51
    2.5 基因盒表达内容与耐药表型的关系分析  51-59
  3 讨论  59-64
    3.1 多重PCR技术检测整合子整合酶基因  59-60
    3.2 四川省不同动物源大肠杆菌整合子流行情况  60
    3.3 整合子阳性菌株基因盒的检测  60-62
    3.4 整合子-基因盒与细菌耐药性之间的关系  62-64
第四章结论和创新  64-66
  1 结论  64
  2 创新  64-66
参考文献  66-71
致谢  71-72
附录  72-73

畜禽肠道大肠杆菌耐药性及整合子—基因盒检测

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