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携P-选择素单抗靶向微泡结合对比超声评价动脉早期血栓效果的研究

作　者: 黄瑞珠
导　师: 宾建平
学　校: 南方医科大学
专　业: 内科学
关键词: 靶向超声微泡对比超声分子成像 P-选择素血栓形成
分类号: R543.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

背景和目的：血栓性疾病包括动、静脉血栓性疾病,是临床常见的急危重症,具有高发性、高致残性和高致死性等特点,严重危害人类生命健康。目前血栓性疾病诊断主要依赖于临床表现和多普勒超声、螺旋CT血管造影、MR血管造影等检查。由于早期新鲜血栓的超声回声与血液回声基本相似,多普勒超声对新鲜血栓的检出率受限；血管造影等非特异性成像检查只有在机体发生明显的病理或解剖结构改变时才能检出异常,对早期急性附壁血栓仍缺乏特异性和敏感性；加之患者早期症状较为隐匿,临床不易察觉,因而在血栓性疾病得到确诊时,受累器官或组织往往已发生不可逆的器质性损伤,进而错过最佳治疗时期。临床迫切需要一种无创、敏感且具有高特异性的技术检测手段对血栓性疾病进行早期、快速、准确、及时的诊断,从而能够早期、及时地对动静脉血栓性疾病进行治疗,以降低患者的死亡率及并发症的发生率。近年来,出现了一门新兴的靶向超声分子成像技术：它通过对普通超声微泡表面进行特殊处理,将靶向于病变组织特定分子的特异配体(抗体、肽等)连接于普通超声微泡外壳,构建成靶向超声微泡,使靶向微泡经静脉注入后靶向粘附、聚集并较长时间滞留于靶组织或器官中,再结合对比超声检查,产生分子水平的特异性的“主动性靶向超声分子成像”。靶向超声分子成像可在机体未发生明显改变时从分子水平无创性早期评价各种组织和器官的病理改变,有高度的特异性和敏感性,有实现对早期血栓诊断与治疗的潜能。目前,国际上已有一些实验室应用精-甘-天冬氨酸(RGD)多肽为配体的靶向血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa(GPⅡb/Ⅲa)的超声微泡成功实现在动物深静脉和心房心耳中血栓的超声分子成像,但对于动脉血栓的超声分子成像研究则鲜有报道。究其原因,除了因为RGD多肽微泡难以抵抗动脉血流高剪切应力的冲刷之外,更重要的原因可能是因为在血小板聚集后期GPⅡb/Ⅲa-Fibrinogen(纤维素)复合物逐渐陷入或移入血小板小管系统,在血小板表面的GPⅡb/Ⅲa受体明显减少,使得RGD多肽微泡在动脉血流环境下难以与其靶标GPⅡb/Ⅲa结合。因此要实现动脉血栓的超声分子成像,我们需要在动脉血栓上寻求新的靶点以解决问题。动脉血栓主要为血小板血栓,在活化血小板上另外存在高度密集的P-选择素为我们提供了另一选择。研究显示,血小板活化后持续高表达P-选择素,在一个活化的血小板膜表面上约有高达10 000个P-选择素分子表达,密度约为350个/μm2,是公认的血小板活化的标志。在急性冠脉综合征、冠脉支架术后、中风及外周动脉疾病等动脉血栓性疾病中,P-选择素在血小板上的表达均有异常增高。Merten等研究发现在血小板聚集过程中,当GPⅡb/Ⅲa-Fibrinogen复合物逐渐陷入或移入小管系统后,血小板表面仅留下大量的P-选择素作为唯一的连接分子,它通过与相邻血小板表面的硫脂类受体相结合,使血小板连接形成大而稳定的血小板血栓。P-选择素作为血小板活化后15 min在血小板聚集的连接区域唯一存在的糖蛋白,在活化血小板上高度密集并持久表达,提示我们可选择P-选择素作为动脉血栓的靶标。因此,本研究在普通脂质微泡的基础上,通过“抗生物素蛋白/生物素复合体”的化学桥接作用将小鼠P-选择素单克隆抗体连接于脂质微泡外壳,构建了携带P-选择素单抗的血栓靶向超声微泡(MBp),创新性将其应用于动脉血栓的活体超声分子成像研究。本研究建立自制的琼脂糖流动腔模型(模拟体内高剪切应力血流环境)和小鼠腹主动脉早期血栓模型,应用MBp与对比超声(CEU)检查相结合,分别对体外制备的血栓以及小鼠腹主动脉早期血栓进行靶向超声分子成像,评价其效果,旨在探索可实现动脉早期血栓超声分子成像的有效超声分子探针。材料和方法：1超声微泡的制备及理化性质鉴定各种脂质材料按一定比例75℃水浴溶解于适量蒸馏水中,同时通全氟丙烷(C3F8)气体,超声振荡至形成乳白色液体,静置弃下清液并加入等量蒸馏水以去除未结合脂质(重复4次)。按一定比例加入抗生蛋白链菌素,静置弃下清液2次,按一定比例加入生物素化抗小鼠P-选择素单克隆抗体,静置过夜后弃下清液2次。同样方法将同型IgG抗体连接在生物素化脂质微泡表面,得到同型对照微泡(MB)。将微泡置于4℃冰箱保存备用。在普通光学显微镜下动态观察微泡的稳定性,采用库尔特计数仪测量MBp和MB的粒径分布及浓度。2采用平行板流动腔技术体外评价MBp与小鼠P-选择素Fc段(Recombinant Mouse P-Selectin/Fc Chimera, PSFc)的靶向黏附效能。2.1结合实验：将200μl的PSFc (1000ng/ml)包被于平行板流动腔的聚苯乙烯培养皿上,等量的MBp和MB(5×106/m1)分别经微量注射泵以4 dyn/cm2的高剪切应力流速通过平行板流动腔(n=3),自显微镜下观察到有微泡出现后开始连续录像6 min,动态观察每分钟微泡与包被于聚苯乙烯培养皿上的PSFc的靶向结合情况；以"0ng/ml PSFc包被(空白组)”为对照。2.2解离实验：平行板流动腔以200μl的PSFc (1000ng/ml)包被,流动腔内分别注入5×106/ml MBp或MB 0.2 ml后静置5 min,先以PBS液(极低剪切应力0.2dyn/cm2条件下)冲洗掉静止但未结合的微泡,待镜下无游离的微泡后,每30 s逐渐增加1次剪切应力,直至微泡完全解离。20倍物镜在固定的视野下全程录像、拍照。3应用琼脂糖流动腔模型体外评价MBp靶向血栓效能自制琼脂糖流动腔模型,将体外制备的新鲜血栓分别悬挂固定在琼脂糖流动腔模型中,将等量的MBp和同型对照微泡(MB)随机先后注入自制琼脂糖流动腔模型内,与血栓孵育30 min后,PBS液15 cm/s流速不间断冲洗血栓,分别在冲洗血栓2、4、6、8、10 mmin时行对比超声检查并测量血栓声强度(Ⅵ)值。根据注入超声微泡的不同分为MBp组和MB组。4小鼠腹主动脉早期血栓模型的制备及CEU检查实验小鼠常规麻醉后,开腹后采用血管内膜损伤法制成小鼠腹主动脉不完全栓塞的早期急性血栓模型。3h后已制备腹主动脉血栓模型的小鼠随机先后注入等量MBp和MB后行CEU检查,并根据注入超声微泡的不同分为MBp组和MB组。行CEU时,保持探头位置和超声各项参数在整个实验过程中不变(参数设置同体外实验)。每只小鼠采用微量加样器经尾静脉随机先后注射MB和MBp的数量约为10×106个(间隔30 min)。在注入微泡6 min后行对比超声,获取第一帧图像后给予高机械指数的连续超声发射2-3 s以破坏微泡,继续存储本底图像2-3帧,全部声学造影图像存于CD盘,以备脱机分析。第一帧图像声强度代表微泡在观察区的总浓度,包括粘附在血栓上的粘附微泡和血池中的循环微泡；微泡破坏后存储图像上的Ⅵ值则代表血池中循环微泡的浓度；前者减去后者则得到粘附在血栓中微泡的浓度。5 CEU图像分析取图结束后,应用MCE分析软件对所得图像进行分析,测量PBS液冲洗2、4、6、8、10 min血栓的Ⅵ值和小鼠腹主动脉血栓的Ⅵ值,采用彩色编码技术制作血栓显影的彩色编码图像,红色、橙色和蓝色依次代表血栓显影的强度由强到弱。6病理学检测图像采集完成后,取体外血栓及小鼠腹主动脉迅速做冷冻切片,行HE染色及免疫组化检查。7统计学分析使用SPSS13.0软件进行统计学分析,所有数据均以x±s表示,差异性检验水准为a=0.05(双侧)。结果：：1超声微泡制备情况显微镜下观察MB和MBp均为透亮微气泡,大小形态一致。采用库尔特计数仪测得MB的平均粒径为2.4±0.3μm,浓度约(5.5-6.8)×108个/ml; MBp的平均粒径为2.6±0.4μm,浓度约为(2.8-4.2)×108个/ml。2采用平行板流动腔技术体外评价微泡与小鼠P-选择素Fc段(PSFc)的靶向黏附效能2.1平行板流动腔结合实验显示,在模拟动脉生理血流条件的高剪切应力(4.0 dyn/cm2)下MBp可与包被于平行板流动腔的PSFc有效结合,6 min后每个视野中仍可见较多粘附的靶向微泡,为(43.00±4.00)个/视野,显示了很好的主动性靶向黏附效能,在空白对照组中MBp几乎不能与PSFc结合；而MB不论在空白对照组还是PSFc包被组均不能与平行板流动腔结合。2.2平行板流动腔解离实验显示,MBp能够抵抗PBS液一定剪切应力的冲刷,MBp半数解离时剪切应力达到(28.13±4.24)dyn/cm2,微泡完全解离时剪切应力高达(96.51±2.71)dyn/cm2;而MB半数解离时及完全解离时剪切应力仅有(7.18±1.44dyn/cm2,P=0.001vs MBp)和(25.52±2.21dyn/cm2,P=0.000vs MBp)。3体外血栓CEU显影图像及Ⅵ值分析体外血栓与MBp孵育后经PBS液冲洗各时间点的CEU图像均可见显著的血栓超声显影；而血栓与MB孵育后经PBS液冲洗各时间点的血栓CEU图像显影强度较前者明显减弱。冲洗10 min后MBp组血栓仍有可视性对比增强,而MB组血栓在冲洗2 min后已无可视性对比增强。冲洗前血栓Ⅵ值MBp组和MB组无显著差异(P>0.05)。冲洗后的血栓Ⅵ值在各时间点MBp组均较MB组大,组间有显著性差异(P=0.000)。4小鼠腹主动脉血栓CEU检查结果及Ⅵ值分析小鼠腹主动脉血栓CEU彩色编码图像显示MBp组的血栓显影显著增强,而MB组的血栓显影几无增强。应用MCE图像软件分析,测量得MBp组血栓的Ⅵ值高达(20.91±2.17)U,而MB组血栓的Ⅵ值仅为(8.18±2.25)U,两组间有显著性差异(t=14.449,P=0.000)。5血栓病理学检测体外血栓及小鼠腹主动脉血栓HE染色切片可见大量淡红色血小板小梁形成,提示其为富含血小板血栓；免疫组化显示血栓表面有明显的P-选择素表达。结论：1体外琼脂糖流动腔实验表明MBp在高剪切应力条件下与血栓的靶向结合稳定可靠,具有较好的血栓靶向效能,MBp与血栓靶向结合后可抵抗一定的剪切应力冲刷。2在体实验表明应用P-选择素靶向超声分子成像可有效评价小鼠腹主动脉血栓形成,可望为临床提供一种切实可行的早期血栓检测手段。3以P-选择素为靶标的MBp可作为动脉早期急性血栓超声分子成像的有效超声分子探针。

全文目录

摘要  3-9
ABSTRACT  9-17
前言  17-25
实验技术路线  25-26
材料与方法  26-34
  1 实验动物及材料  26-27
    1.1 实验动物  26
    1.2 主要实验试剂  26-27
    1.3 主要实验仪器  27
  2 实验方法  27-34
    2.1 超声微泡的制备  27-28
    2.2 超声微泡的库尔特计数仪检测和显微镜观察  28
    2.3 平行板流动腔技术体外评价MBp与小鼠P-选择素Fc段(RecombinantMouse P-Selectin/Fc Chimera,PS_(Fc)的靶向黏附效能  28-29
    2.4 琼脂糖流动腔模型评价MBp靶向体外血栓的超声分子成像效果  29-31
    2.5 靶向血栓超声分子成像评价小鼠腹主动脉早期血栓形成  31-32
    2.6 HE染色  32
    2.7 免疫组化  32-33
    2.8 统计分析  33-34
结果  34-43
  1 超声微泡制备情况  34-35
  2 平行板流动腔体外评价结果  35-37
  3 琼脂糖模型实验结果  37-39
  4 动物实验  39-42
  5 血栓病理与免疫组化  42-43
讨论  43-48
参考文献  48-52
综述  52-63
  参考文献  60-63
缩略词表  63-64
成果  64-65
致谢  65-68
统计学证明  68

携P-选择素单抗靶向微泡结合对比超声评价动脉早期血栓效果的研究

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