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青少年特发性脊柱侧凸患者成骨细胞中核因子κB受体活化子配体和骨保护蛋白的表达

作　者: 殷刚
导　师: 邱勇
学　校: 南京医科大学
专　业: 外科学
关键词: 青少年脊柱侧凸成骨细胞单层培养骨密度 RANKL OPG
分类号: R687.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

青少年特发性脊柱侧凸患者成骨细胞中核因子κB受体活化子配体和骨保护蛋白的表达1.青少年成骨细胞的体外分离、培养、扩增及表型鉴定目的建立青少年成骨细胞(osteoblast,OB)体外分离、培养、扩增及表型鉴定的方法,为后续分子生物学检测做准备。方法所有研究对象分为2组:青少年特发性脊柱侧凸( adolescent idiopathic scoliosis ,AIS)组和正常对照组。其中AIS组包括患者20例。女15例,男5例;年龄11~19岁,平均年龄14.75岁;术前Cobb角40°~96°,平均59.65°。正常对照组8例,为非脊柱侧凸患者,女2例,男6例,年龄10～19岁,平均年龄15.25岁。所有受试者均需取右侧髂松质骨行植骨融合,在病人知情同意和不影响手术疗效的情况下取少许松质骨标本。胰蛋白酶预消化后植块法分离培养OB,原代培养并传至P2代行细胞记数,同时记录细胞样本各代的增值时间。取P2代细胞通过碱性磷酸酶染色、钙节结染色及RT-PCR检测骨钙素表达行OB的表型鉴定。结果两组胰蛋白酶预消化后植块法分离所得的原代OB均呈贴壁生长。体外培养第5~6天可见少量贴壁细胞,培养第4周见植块周围细胞密集,已呈重叠生长,植块间细胞也接近融合,细胞形态趋向较均匀的短梭形。P2代细胞总数平均可达0.5×107个。两组细胞各代平均增值时间无统计学差异(P>0.05),从P0～P2代平均约需45天。P2代细胞经碱性磷酸酶染色、钙节结染色及RT-PCR检测骨钙素表达鉴定证实获得和培养的细胞为典型的OB。结论AIS患者与正常对照组在体外分离、培养、扩增OB时所表现的生长及增殖特性一致。目的从成骨细胞(osteoblast,OB)水平探讨核因子κB受体活化子配体( receptor activator of NFκB ligand,RANKL)、骨保护蛋白(osteoprotegerin,OPG)与青少年特发性脊柱侧凸(adolescent idiopathic scoliosis ,AIS)患者骨量降低的关系。方法本实验分为两组:AIS组,20例(男5例,女15例),年龄11 ~19岁,平均14.75岁,Cobb角40°~96°,平均59.65°;同年龄对照组,8例(男6例,女2例),年龄10~19岁,平均15.25岁。AIS组及对照组均采用双能X线吸收测量仪(dual-energy x-ray absorptiometry,DEXA)测量骨密度(bone mineral density,BMD),测量部位包括非优势侧股骨近端及腰椎。所有受试者术中取适量髂前上嵴的松质骨,运用植块法培养成骨细胞。培养至P2代使用RT-PCR和Western blotting检测AIS组和正常对照组中RANKL和OPG的mRNA及蛋白表达的情况。结果AIS组腰椎(L2~L4)及股骨近端的BMD值明显低于正常对照组。RT-PCR和Western blotting显示:1. AIS组中RANKL的核酸及蛋白水平的表达量均较正常对照组高( P<0.01)。2. AIS组与正常对照组OPG的核酸及蛋白水平的表达量无明显统计学差异(P>0.05)。3. AIS组RANKL /OPG比值明显高于正常对照组(P<0.01)。结论成骨细胞中RANKL及OPG在核酸及蛋白水平的表达异常可能与AIS骨量降低的分子机制相关。

全文目录

中文摘要  3-5
英文摘要  5-8
前言  8-22
  第一节青少年特发性脊柱侧凸简介  8-11
  第二节 AIS 的病因学及低骨量研究进展  11-14
  第三节 RANKL-RANK-OPG 调节轴与骨重塑的关系  14-16
  第四节本课题的研究思路及内容  16-17
  参考文献  17-22
第一部分：青少年成骨细胞的体外分离、培养、扩增及表型鉴定  22-33
  材料与方法  22-27
  结果  27-29
  讨论  29-31
  参考文献  31-33
第二部分：核因子κB 受体活化子配体和骨保护蛋白的表达与青少年特发性脊柱侧凸患者骨量降低的关系  33-50
  资料和方法  33-39
  结果  39-43
  讨论  43-47
  参考文献  47-50
结论  50-51
文献综述  51-57
  参考文献  54-57
附录、试剂配制  57-62
攻读学位期间发表论文情况  62-63
致谢  63

青少年特发性脊柱侧凸患者成骨细胞中核因子κB受体活化子配体和骨保护蛋白的表达

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