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Hedgehog信号通路在胃癌发生发展中的作用及机制探讨

作　者: 袁小刚
导　师: 吕农华；罗时文
学　校: 南昌大学
专　业: 内科学
关键词: Hh信号通路胃癌癌前病变 Cyclopamine
分类号: R735.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

研究背景：胃癌是全世界发病率和死亡率均非常高的恶性肿瘤,全球近半数胃癌发生在我国,并且近年来发病呈年轻化的趋势。目前胃癌的总体治疗效果仍然非常差,其发病机制尚不清楚,也缺乏特异性治疗药物。国内外研究表明针对细胞信号转导通路的某些分子靶点研制靶向治疗药物是提高恶性肿瘤整体疗效的重要措施之一。Hedgehog(Hh)信号通路在胚胎发育、维持细胞增殖与凋亡动态平衡、组织损伤与修复以及多种恶性肿瘤的发生、发展中发挥重要作用。研究表明Sonic Hedgehog(SHH)信号通路的异常激活可能与胃癌有关,但其具体的分子机制目前尚不清楚,且在慢性浅表性胃炎→萎缩性胃炎→肠上皮化生→异型增生→胃癌这一经典的胃粘膜癌变过程中的表形也未见系统的研究报道。为此,本课题旨在通过临床病理标本及体外研究探讨Hh信号通路在胃粘膜癌变过程中的变化规律及其可能的分子作用机制,为胃癌分子靶向治疗研究提供新思路。研究目的：1、研究Hh信号通路中的关键因子：Shh、Smo、SuFu、Glil、Gli2和Gli3以及细胞周期调控蛋白CyclinD1在慢性浅表性胃炎→萎缩性胃炎→肠上皮化生→异型增生→胃癌这一胃粘膜癌变过程中的表达特征,探讨其临床意义。2、研究Hh信号通路与CyclinD1的表达、胃粘膜上皮细胞增殖、凋亡及胃癌临床病理参数之间的关系,探讨Hh信号通路在胃癌发生发展中的分子作用机制。3、研究Hh信号通路阻断剂Cyclopamine对胃癌细胞增殖及Glil、CyclinD1蛋白表达的影响,进一步探讨Hh信号通路在胃癌中的作用机制。研究方法：一、临床病理标本研究部分选取南昌大学第一附属医院2007年1月至2009年9月胃镜活检或外科手术病理标本共186例,其中慢性浅表性胃炎(Chronic superficial gastritis, CSG)44例,萎缩性胃炎(化生性萎缩性胃炎,Metaphastic atrophy gastritis, MAG) 44例,异型增生(Dysplasia, Dys)48例,胃癌(Gastric cancer, GC)50例为研究对象,同时收集临床病理资料。通过HE染色确定病理诊断,采用免疫组织化学二步法检测Hh信号通路中的关键因子：Shh、Smo、SuFu、Gli1、Gli2和Gli3以及细胞周期调控蛋白CyclinD1的表达,同时检测增殖细胞核抗原PCNA的表达。采用脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)技术研究细胞调亡。二、体外研究部分通过不同浓度的Cyclopamine作用于胃癌细胞MKN28不同时间(24h、48h及72h),用倒置显微镜观察细胞形态,四唑蓝(MTT)比色试验检测细胞的生长抑制率,蛋白印迹(Western Blot,WB)方法检测阻断Hh信号通路后对Gli1及CyclinD1蛋白表达的影响。研究结果：一、临床病理标本研究部分(1)Shh在Dys组表达最高,MAG组最低：MAG组显著低于CSG组(P=0.003<0.01)；GC组也显著低于CSG组(P=0.035<0.05)。(2)胃黏膜癌变过程中Smo的表达发生了显著变化,GC组中Smo呈低表达,与CSG组比较无显著性差异(P=0.051>0.05),但显著低于MAG组及Dys组(P<0.001)。(3)胃黏膜癌变过程中SuFu的表达逐渐降低,GC组显著低于其他3组(P均<0.001)。(4)Gli1在胃癌组织中异常表达,且细胞核染色阳性率显著增高。GC组Glil的表达显著高于CSG组(P=0.001<0.05),与其他2组比较差异无统计学意义(P>0.05)；细胞核染色阳性率GC组(32.00%)显著高于CSG组(4.55%)、MAG组(6.82%)及Dys组(8.33%)。Glil的表达与胃癌分化程度、浸润深度、TNM分期及淋巴结转移密切相关(P<0.05)。(5)GC组Gli2的表达显著低于CSG组(P=0.001<0.05),与其他2组比较差异无统计学意义(P均>0.05)。(6)GC组Gli3的表达显著低于其他3组(P<0.001或0.05)。(7)胃黏膜癌变过程中CyclinD1蛋白表达显著逐渐升高,GC组显著高于CSG组及MAG组(P<0.01),与Dys各组比较差异无统计学意义(P=0.245>0.05)；(8)PCNA在GC组表达显著高于CSG及MAG组(P<0.05),与Dys各组比较差异无统计学意义(P=0.472>0.05)；(9)细胞凋亡指数GC组(4.08±1.41)及Dys组(6.14±1.56)均显著低于CSG组(12.54±4.23)及MAG组(21.37±6.27)(P<0.01)。(10)在胃粘膜癌变过程中Gli1的表达与CyclinD1的表达呈显著正相关(R=0.214,P=0.003<0.01);与PCNA的表达也呈正相关(R=0.145,P=0.048<0.05)；与细胞凋亡呈显著负相关性(R=0.278,P=0.002<0.01)。二、体外研究部分(1) Cyclopamine阻断Hh信号通路后,胃癌细胞MKN28出现类似凋亡样的形态改变,增殖受到显著抑制,并呈浓度及时间依赖性。(4)阻断Hh信号通路后,显著下调CyclinD1的表达,Gli1表达总量却未见明显下调。结论：1、胃粘膜癌变过程中Hh信号通路发生异常活化。2、Hh信号通路的异常活化与胃癌分化程度、浸润深度、TNM分期及淋巴结转移密切相关。3、阻断Hh信号通路可下调CyclinD1的表达,抑制MKN28细胞增殖。

全文目录

摘要  3-6
ABSTRACT  6-14
第1章引言  14-19
第2章 Hh信号通路与胃癌发生发展的关系  19-46
  2.1 实验材料和方法  19-25
    2.1.1 研究对象  19
    2.1.2 主要仪器  19-20
    2.1.3 主要试剂  20-21
    2.1.4 实验方法  21-25
    2.1.5 数据的统计分析  25
  2.2 实验结果  25-40
    2.2.1 一般资料  25-26
    2.2.2 Shh在胃癌及癌前病变中的表达及其临床意义  26-27
    2.2.3 Smo在胃癌及癌前病变中的表达及其临床意义  27-29
    2.2.4 SuFu在胃癌及癌前病变中的表达及其临床意义  29-31
    2.2.5 Gli1在胃癌及癌前病变中的表达及其临床意义  31-33
    2.2.6 Gli2在胃癌及癌前病变中的表达及其临床意义  33-35
    2.2.7 Gli3在胃癌及癌前病变中的表达及其临床意义  35-36
    2.2.8 CyclinD1在胃癌及癌前病变中的表达及其临床意义  36-37
    2.2.9 胃癌及癌前病变中上皮细胞的增殖与凋亡  37-40
    2.2.10 胃癌及癌前病变中Gli1与CyclinD1蛋白表达的相关性  40
    2.2.11 胃癌及癌前病变中Gli1蛋白的表达与上皮细胞增殖和凋亡的关系  40
  2.3 讨论  40-46
第3章 Hh信号通路阻断剂Cyclopamine对胃癌细胞的影响  46-57
  3.1 实验材料和方法  46-53
    3.1.1 细胞系  46
    3.1.2 主要仪器  46-47
    3.1.3 主要试剂  47-48
    3.1.4 实验方法  48-53
    3.1.5 数据的统计分析  53
  3.2 实验结果  53-55
    3.2.1 Cyclopamine对胃癌细胞MKN28生长增殖的影响  53-55
    3.2.2 Cyclopamine阻断Hh信号通路后对MKN28细胞Gli1及CyclinD1蛋白表达的影响  55
  3.3 讨论  55-57
第4章结论  57-58
致谢  58-59
参考文献  59-65
攻读学位期间的研究成果  65-67
综述  67-75
  参考文献  73-75

Hedgehog信号通路在胃癌发生发展中的作用及机制探讨

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