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黄牛和水牛INHA基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定及功能研究

作　者: 赵延森
导　师: 陈世林；杨利国
学　校: 华中农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: RNAi shRNA 颗粒细胞抑制素干扰
分类号: S823
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

抑制素(inhibin, INH)是由卵巢颗粒细胞和睾丸支持细胞生成和分泌的糖蛋白类激素,是由α-和β-两个亚基通过二硫键连结而成的异二聚体,其中α亚基是抑制素发挥生理功能所必需的。抑制素对雌性动物的主要作用是通过抑制促卵泡素(FSH)的合成和分泌而抑制卵泡发育,促进颗粒细胞的凋亡；对雄性动物的具体作用为抑制精子的发生,降低睾丸的生精能力。因此,干扰抑制素α亚基基因的表达,可降低动物体内的抑制素水平,进而促进卵泡发育和精子的生成,提高排卵率。但是,完全干扰抑制素的合成或分泌是否对动物生殖活动及其他生理机能的维持有影响,尚无文献报道。本研究选择INHA基因作为靶基因,分别设计了7个短发夹RNA序列(shRNA),采用Gateway克隆技术,分三步构建了表达shRNA的慢病毒载体Va、Vb、Vc、Vd、VH1、Vy、Vs,并包装了表达GFP的慢病毒VGFP进行转染293FT细胞,通过监测绿色荧光强度,旨在比较这7种载体及其相互组合的整合能力、干扰效果、物种特异性和介导方式,为阐明抑制素干扰水平与繁殖及其他生理机能维持的关系,建立适于干扰黄牛和水牛抑制素的转基因动物生产方法提供技术支撑。结果如下：1、适于黄牛的慢病毒载体及其对INH基因表达的抑制率Va、Vb、Vc、Vd、VH1对黄牛INH基因表达的抑制效果显著,而阴性对照载体Vy对黄牛INH基因表达无抑制作用。其中Va和Vb对黄牛IHN基因表达的抑制率均在97%以上,具有高效抑制作用；Vc和Vd对黄牛IHN基因表达的抑制率分别为68.36%和82.0%,具有中效率抑制作用；Lvd和VH1对黄牛IHNA基因表达的抑制率分别为28.30%和35.39%,具有低效抑制作用。2、适于水牛的慢病毒载体及其对INH基因表达的抑制率Vb、Vc、Vd和Vs对水牛INH基因表达的抑制效果显著。其中Va、Vb和Vd对水牛INH基因表达,具有高效抑制作用；Vc和Vs对水牛INH基因表达的抑制率分别为69.01%和66.55%,具有中效抑制作用。3、不同载体组合对INHA基因表达的抑制率取Va、Vb、Vc、Vd和VH1各100μl,制成混合载体Y后转染黄牛卵巢颗粒细胞,72h后发现混合物对黄牛INH基因表达抑制效果不明显。取Va和Vb各250μl制成混合载体E；取Va、Vb和Vc各167μl制成混合载体F；取Va、Vb和Vd各167μl制成混合载体H；取Vc和Vd各250μl制成混合载体J；取Va、Vb、Vc和Vd制成混合载体N,分别转染水牛卵巢颗粒细胞,72h后发现E、F、H、J和N对水牛INHA基因表达的抑制效果显著,其中F、H和J对水牛INHA基因表达的抑制率均在93%以上,具有高效抑制作用；E和N对水牛INHA基因表达的抑制率分别为45.6%和65.13%,具有中效抑制作用。这些结果说明,载体等量组合后,各自的干扰能力发生了变化。4、与质粒DNA载体Lvd介导的RNAi效率比较Lvd对INH基因表达的抑制率为28.30%,远低于Vd的抑制率82.20%。这说明质粒DNA载体介导的RNAi效率低于慢病毒载体。5、慢病毒载体的整合能力经VGFP转染的293FT细胞培养传代至39d时,仍可观察到绿色荧光,且荧光强度没有明显减弱,细胞形态正常,这说明慢病毒载体整合到了宿主基因组且对宿主生长无影响。结论：Va、Vb、Vc和Vd能有效抑制黄牛和水牛INHA基因的表达。靶序列同源性较高且位置较近时,干扰效果相近。不同的载体组合对靶基因表达的抑制率不同,靶序列相近的两个载体组合后,两载体各自的干扰能力下降；靶序列不同的两个载体组合后,两载体各自的干扰能力增强；靶序列相近的两个载体与一个靶序列不同的载体组合后,三者各自的干扰能力都得到了增强,且随着靶序列位置差距的增大,增强幅度加大；当组合中多于三个载体时,各自的干扰能力都降低,且降低幅度很大。靶序列处在靶基因末端时,即使只有7个碱基匹配也同样可以发生干扰。慢病毒载体对靶基因表达抑制效果优于质粒DNA载体。VGFP携带的GFP在293FT细胞内的持续表达说明,本研究包装的病毒载体可将外源基因整合到宿主染色体,使之持续稳定的表达,且可稳定的遗传给后代细胞,可用于后期的转基因动物制备以及基因治疗。

全文目录

摘要  7-9
Abstract  9-11
缩略词表  11-12
1 前言  12-39
  1.1 研究问题的由来  12-13
  1.2 文献综述  13-37
    1.2.1 抑制素的研究进展  13-20
    1.2.2 黄牛和水牛INHA基因的研究现状  20
    1.2.3 RNAi的研究进展  20-26
    1.2.4 慢病毒载体的研究进展  26-31
    1.2.5 慢病毒载体介导RNAi技术的应用现状  31-37
  1.3 研究目的和意义  37-39
2 材料和方法  39-54
  2.1 材料  39-40
    2.1.1 主要试剂和耗材  39
    2.1.2 主要仪器设备  39-40
  2.2 方法  40-54
    2.2.1 shRNA列设计  40-42
    2.2.2 pENTR/U6-INHA-shRNA vector构建和鉴定  42-46
    2.2.3 LV-U6-INHA-shRNA载体的构建和鉴定  46-47
    2.2.4 慢病毒包装  47-50
    2.2.5 慢病毒转染黄牛和水牛GCs及对INHA基因相对表达量的测定  50-54
3 结果与分析  54-64
  3.1 PENTR/U6-INHA-sHRNA载体  54-55
    3.1.1 pENTR/U6-INHA-shRNA质粒基本特性  54
    3.1.2 pENTR/U6-INHA-shRNA质粒序列  54-55
  3.2 Lv-U6-INHA-sHRNA载体  55-56
    3.2.1 Lv-U6-INHA-shRNA质粒基本特性  55-56
    3.2.2 Lv-U6-INHA-shRNA质粒序列  56
  3.3 转染后的病毒特性  56-57
  3.4 293FTG细胞系的特性  57-58
  3.5 BGC BLASTICIDIN毒性  58-59
  3.7 病毒滴度  59-64
    3.7.1 cDNA的特异性  60
    3.7.2 c-INHA的相对表达量  60-61
    3.7.3 b-INHA的相对表达量  61-62
    3.7.4 INHA在bGC和cGC中的表达水平差异极显著  62-63
    3.7.5 同一病毒载体对c-INHA和b-INHA基因表达抑制率不同  63-64
4 讨论  64-73
  4.1 关于PENTR/U6-INHA-sHRNA载体的构建方法  64-65
  4.2 关于Lv-U6-INHA-SHRNA载体的构建方法  65-66
  4.3 慢病毒的生产和滴度测定的讨论  66-67
  4.4 干扰机制和效果的讨论  67-73
    4.4.1 黄牛和水牛卵巢颗粒细胞中INHA基因表达水平不同  68
    4.4.2 慢病毒载体对c-IHNA基因表达的抑制效果  68-70
    4.4.3 慢病毒载体对b-IHNA基因表达的抑制率  70
    4.4.4 不同载体组合对靶基因表达抑制效果不同  70-72
    4.4.5 慢病毒载体与质粒DNA载体对靶基因表达的抑制效果不同  72
    4.4.6 慢病毒载体分别对c-INHA和b-INHA基因表达的抑制效果比较  72-73
  4.5 293FTG细胞系的建立  73
5 结论  73-76
参考文献  76-87
附录Ⅰ 载体序列比对结果  87-99
附录Ⅱ 质粒图谱  99-101
致谢  101

黄牛和水牛INHA基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定及功能研究

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