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Zfy基因干扰对小鼠性别控制的研究

作　者: 彭强
导　师: 贾斌
学　校: 石河子大学
专　业: 基础兽医学
关键词: RNAi 小鼠精子生成性别控制
分类号: S814.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

睾丸是雄性最重要的生殖腺,它是雄性激素分泌及精子发生的场所。Zfy基因位于Y染色体的短臂上,与精子的形成与发生相关,作为一个较强的转录激活因子,引导靶基因穿过核膜,定位于精子细胞核内,可能对精子变态过程中的某些基因具有转录激活作用。本研究根据Zfy基因特点,设计shRNA片段,进行Zfy基因的RNAi实验,采用RT-PCR分析干扰后Zfy基因的mRNA表达水平,并统计经干扰后子二代的性别比例。具体研究结果如下：1.根据Gen Bank提供的小鼠Zfy基因mRNA序列,针对该基因的编码区,设计并合成了shRNA干扰片段。以Ambion公司pSilencer5.1-H1 Retro为载体,构建小鼠靶向Zfy基因的shRNA表达载体pSilencer5.1/Zfy215及pSilencer5.1/Zfy2102,经酶切和序列测定证实,实验所构建的表达载体中含有设计合成的干扰序列,且插入序列的位置及方向均正确,上下游表达调控元件完整。说明两个shRNA表达载体构建成功,可以用于小鼠Zfy基因干扰实验。2.将构建的两个Zfy基因siRNA重组表达载体进行小鼠体内RNAi的研究。选取64只雄鼠随机分成四组(每组16只),第一组、第二组为试验组,分别注射重组质粒p215与p2102,第三组与第四组作为对照组,分别注射同等体积的空载体pSilencer5.1-H1 Retro及生理盐水。间隔10天注射一次,连续注射4次。最后一次注射17d后,每组8只雄鼠按1：1与雌鼠交配,另外8只采集睾丸组织,利用荧光实时定量PCR法检测Zfy基因：mRNA的表达水平。结果表明,pSilencer5.1/Zfy2102干扰后Zfy基因的mRNA表达水平与对照组差异极显著(P<0.01)。繁殖试验表明后代雌鼠率达到72.3%,极显著高于对照组(P<0.01)。pSilencer5.1/Zfy215干扰后,Zfy基因的mRNA表达水平与对照组差异显著(P<0.05),后代雌鼠率与对照组无显著差异。本文通过沉默生精过程中Zfy基因的表达,影响了Y精子的形成。值得指出的是,试验组与对照组子鼠数量及体重无显著差异,这可能表明沉默Zfy基因对早期胚胎发育没有影响。同时,将子一代的雌鼠与雄鼠饲养至性成熟并进行交配,子二代鼠的数量及体重与未进行任何处理的后代鼠间均无显著差异,说明干扰Zfy基因所产生的精子受精后不影响后代子的繁殖性能。通过干扰Zfy的表达成功实现了对小鼠进行受精前的性别控制,同时也为在其他动物的受精前的性别控制奠定了基础。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-11
前言  11-13
RNA干扰的原理、机制及在动物繁殖中的应用  13-33
  1. RNAi的研究历史  13-14
  2. RNAi的作用机理  14-18
  3. siRNAs的常见制备  18-22
  4. siRNA的介导途径  22-26
  5. siRNA的体内导入途径  26-27
  6. 检测RNAi结果的方法  27-28
  7. RNAi的生物学意义  28-30
  8. RNAi技术在动物繁殖中的应用  30-32
  9. 展望  32-33
试验研究  33-54
  实验一小鼠Zfy基因shRNA表达载体的构建  33-43
    1. 材料与方法  33-38
      1.1 主要试剂  33-34
      1.2 主要仪器  34
      1.3 方法  34-38
    2. 结果与分析  38-40
      2.1 靶序列的选择  38-39
      2.2 表达载体的克隆与酶切鉴定  39
      2.3 重组表达质粒的测序鉴定  39-40
    3. 讨论  40-43
      3.1 RNAi的作用机制  40-41
      3.2 siRNA的设计原则  41-42
      3.3 重组质粒的鉴定  42-43
  实验二 Zfy基因shRNA表达载体的体内RNA干扰试验  43-54
    1. 材料与方法  43-47
      1.1 主要试剂  43-44
      1.2 主要仪器  44
      1.3 实验动物  44
      1.4 Zfy基因RNAi重组载体构建  44
      1.5 重组质粒的大量制备与纯化  44-45
      1.6 Zfy基因体内RNAi试验  45
      1.7 qRT-PCR测定睾丸Zfy mRNA表达水平  45-47
      1.8 数据统计  47
    2. 结果与分析  47-52
      2.1 PCR扩增结果  47-48
      2.2 Zfy mRNA的表达水平  48-51
      2.3 后代的性别比例  51-52
    3. 讨论  52-54
参考文献  54-64
结论  64-65
创新点  65-66
致谢  66-67
作者简介  67-68
导师评阅表  68

Zfy基因干扰对小鼠性别控制的研究

内容摘要

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