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水貂阿留申病毒实时定量PCR检测方法的建立、全基因分析及VP2基因主要功能区的原核表达与鉴定

作　者: 张瑞
导　师: 许兰菊
学　校: 河南农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 水貂貂阿留申病毒实时定量PCR 全序列测定 VP2基因原核表达
分类号: S858.92
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

水貂阿留申病(AD)是由细小病毒亚科(Parvovirinae)貂阿留申病毒属(Amdovirus)水貂阿留申病毒(Aleutian mink disease virus,ADV)引起的免疫系统病理性失调,主要导致水貂的慢性传染性疾病。该病主要以水平、垂直两种形式在世界各地貂群中传播,使貂的繁殖力和毛皮质量下降,给养貂业造成极其严重的经济损失。近年,貂阿留申病在我国水貂养殖区流行的情况时有报道,严重阻碍了我国水貂养殖业的发展。因此,对国内貂阿留申病毒的分离鉴定和分子生物学特性研究,建立适应国内毒株的血清学诊断方法,将会对今后我国开展貂阿留申病的临床诊断、有效防制及进一步深入研究,提供更多的科学依据。在本研究中,首先根据GenBank上登录的貂阿留申病毒全基因序列,比对后根据其保守区域,设计一对特异性引物,采用SYBR GreenⅠ随机结合渗入法,建立该模式的实时定量PCR检测方法,构建了检测ADV的标准DNA模版,循环阈值(Ct值)与标准质粒DNA模板在0.78×101～0.78×108拷贝/μl浓度范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.9967。该方法对貂阿留申病毒的检测具有很高的特异性,其敏感性与常规PCR相比可以提高100倍,可以用于貂阿留申病毒的快速检测。其次,依据标准毒株ADV-G及强致病性毒株ADV-Utah1的DNA序列设计并合成五对引物对两株(ADV-LN1、ADV-LN2)中国毒株进行全基因的PCR扩增,产物克隆到pMD18-T载体并测序。与已报道欧美毒株进行全基因序列比对分析,结果显示:ADV-LN1与ADV-G、ADV-Utah1、ADV-SL3相比,最高同源性为94.0%(ADV-Utah1),ADV-LN2与ADV-G、ADV-Utah1、ADV-SL3相比,最高同源性为94.9%(ADV-Utah1);遗传进化树分析,ADV-LN1、ADV-LN2与参考毒株ADV-G、ADV-Utah1、ADV-SL3属于不同的分支,亲缘关系较远。因此我们可以得出这样的结论:本试验所分离的中国毒株可能为远离欧美的新毒株或是因为ADV高度遗传多样性导致欧美毒株在我国长时间演化变异而来。同时,通过对所测毒株与其它细小病毒属的遗传进化分析可以看出:ADV与其它四个属的成员分属于不同的分支,而ADV之间的遗传关系较近,从而进一步验证了国际病毒分类委员会(ICTV)第八次报告新分类体系的合理性。最后,根据已完成测序的中国毒株ADV-LN1、ADV-LN2 VP2基因序列,设计一对特异性引物,应用PCR扩增,将PCR产物克隆入pMD-18T载体,进行测序分析。双酶切测序后重组质粒pMD-18T-M到目的片段连接至原核表达载体pET-28a(+)上,构建重组质粒pET-28a(+)-M。转化至BL21宿主菌,对诱导表达条件(诱导温度、IPTG浓度、诱导时间)进行优化,结果在37℃,1.0 mmol/L IPTG诱导5 h可实现重组M蛋白的高效表达。该重组M蛋白经Ni-NTA亲和层析柱纯化后,Western-blotting分析显示,重组M蛋白与ADV阳性血清发生特异性反应。综上所述,本试验制备的重组M蛋白具有良好的免疫学反应活性,这为水貂阿留申病毒血清学诊断方法的建立奠定了基础。总之,本研究初步建立了国内貂阿留申病毒株SYBR GreenⅠ模式的定量PCR检测方法,为ADV的快速诊断提供了有效的技术手段。同时,本试验完成了两株国内ADV毒株的全序列测定,为研究国内ADV病毒株的进化规律和演化特点提供基础性材料;ADV VP2蛋白主要功能区基因通过原核表达载体pET-28a(+)得到了高效表达,这为ADV血清学诊断方法的建立奠定了基础。

全文目录

致谢  4-7
中文摘要  7-9
1 文献综述  9-22
  1.1 水貂阿留申病病原学  9-11
  1.2 貂阿留申病毒的分子生物学特性  11-16
  1.3 水貂阿留申病概述  16-21
  1.4 本研究的目的意义  21-22
2 水貂阿留申病毒SYBR GreenⅠ模式实时定量PCR 检测方法的建立  22-31
  2.1 材料与方法  22-26
    2.1.1 试验材料  22
    2.1.2 试验方法  22-26
  2.2 结果与分析  26-29
    2.2.1 普通PCR 结果与测序分析  26
    2.2.2 标准DNA 模板的制备  26-27
    2.2.3 动力学曲线扩增和标准曲线的制备  27
    2.2.4 扩增产物的溶解曲线分析  27-28
    2.2.5 貂阿留申病毒的特异性检验  28
    2.2.6 与常规PCR 敏感性比较  28-29
  2.3 结论与讨论  29-31
3 水貂阿留申病毒辽宁株全基因的克隆与序列分析  31-45
  3.1 材料与方法  31-33
    3.1.1 试验材料  31
    3.1.2 试验方法  31-33
  3.2 结果与分析  33-44
    3.2.1 PCR 扩增结果  33
    3.2.2 重组质粒的鉴定  33
    3.2.3 ADV-LN1、ADV-LN2 与貂阿留申病毒参考毒株的序列比较  33-43
    3.2.4 ADV-LN1、ADV-LN2 及细小病毒亚科各属代表毒株的遗传分析  43-44
  3.3 结论与讨论  44-45
4 水貂阿留申病毒 VP2 主要功能区基因的克隆、原核表达及鉴定  45-56
  4.1 材料与方法  45-49
    4.1.1 试验材料  45
    4.1.2 试验方法  45-49
  4.2 结果与分析  49-54
    4.2.1 PCR 扩增结果  49-50
    4.2.2 重组质粒 pMD18T-M 的酶切  50
    4.2.3 重组质粒 pMD18T-M 的测序  50-51
    4.2.4 重组质粒 PET-28a-M 的鉴定  51
    4.2.5 SDS-PAGE 电泳及诱导条件的优化  51-52
    4.2.6 重组蛋白的纯化  52-53
    4.2.7 重组蛋白的复性  53
    4.2.8 重组蛋白的免疫印迹鉴定  53-54
  4.3 结论与讨论  54-56
全文总结  56-57
参考文献  57-64
ABSTRACT  64-65

水貂阿留申病毒实时定量PCR检测方法的建立、全基因分析及VP2基因主要功能区的原核表达与鉴定

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