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犬猫带绦虫线粒体基因组学研究

作　者: 刘国华
导　师: 刘毅；朱兴全
学　校: 湖南农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 带绦虫线粒体基因组全序列测定 DNA序列分析种系发育关系
分类号: S852.734
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

寄生于犬科和猫科动物的绦虫属于圆叶目（Cyclophyllidea）和假叶目（Pseudophyllidea）,其中以圆叶目的带科绦虫最为常见,其中多种犬猫带绦虫的中绦期蚴虫可感染人,引起各种症状,是重要的人兽共患寄生虫病,在公共卫生学上具有重要意义。本项研究以犬猫绦虫为主要研究对象,以线粒体基因组为主要研究内容,对寄生于犬和猫的多头带绦虫、泡状带绦虫、带状带绦虫的线粒体部分基因的多态性、以及多头带绦虫、泡状带绦虫、带状带绦虫全基因序列进行了全面的研究。本研究的第一个目的:应用PCR和DNA序列分析方法,对多头带绦虫、泡状带绦虫、带状带绦虫的线粒体DNA（mtDNA）中的两个基因片段,即细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ（cox1）基因和烟酰胺脱氢酶亚基Ⅳ（nad4）基因进行了多态性分析,以期找到研究多头带绦虫、泡状带绦虫、带状带绦虫分子分类学、种群遗传关系良好的遗传标记。从线粒体二个基因片段核苷酸序列分析结果可以看出,pcox1序列种内差异为0%-0.7%,种间差异为12.1%-17.6%,343bp的pcox1有7个种间遗传标记位点;pnad4序列种内差异为0%-1.7%,种间差异为18.7%-26.2%,种间差异明显,而643bp的pnad4有25个种间遗传标记位点。通过对线粒体cox1和nad4基因序列的多态性分析,显示这些基因均可作为多头带绦虫、泡状带绦虫和带状带绦虫理想的种特异的遗传标记。研究结果表明:线粒体nad4基因进化速度较快,存在的种间遗传位点较多。线粒体DNA（mtDNA）是后生动物胞核外的遗传物质,它具有分子量小、结构简单、进化速度快、母性遗传等特点,是研究寄生虫分子分类、群体遗传、系统进化的一种很好的分子标记。绦虫是动物界比较大的动物群体,但是,迄今为止,只有15种（株）绦虫mtDNA被完整测序。因此,对绦虫mtDNA的了解还相当肤浅。为了丰富绦虫mtDNA内容,本研究的第二个目的:选择多头带绦虫、泡状带绦虫和带状带绦虫作为mtDNA完整测序的对象,采用长PCR扩增方法,用引物对分别扩增出长约5.0kb和9.0kb的两个mtDNA片段,送测序公司进行测序。测序结果分析显示:多头带绦虫线粒体基因组全长为13700bp(GenBank^TM中注册号FJ495086),A+T含量为71.3%;泡状带绦虫13489bp(GenBank^TM中注册号FJ 518620),A+T含量为70.8%;带状带绦虫13647bp(GenBank^TM中注册号FJ 597547),A+T含量为73.0%。三种带绦虫mtDNA全基因组由12个蛋白质基因、2个rRNA基因、22个tRNA基因组成,均缺乏基因atp8。多头带绦虫和泡状带绦虫都有两个非编码区（AT区）全长250bp和191bp。而带状带绦虫只有一个长非编码区（AT区）长414bp。各基因排序方式与其它绦虫完全一致,基因之内没有内含子,各基因之间没有基因间隔或有一到几十个碱基的基因间隔。在12个编码蛋白质的基因中,以ATG、GTG作为蛋白质翻译的起始密码子;多数蛋白质翻译的终止密码子为TAA,其次是TAG。以猪蛔虫为外群,以mtDNA作为遗传标记,重构了绦虫的系统发育关系。结果显示:分为两个进化支,一个是假叶目的双叶槽科;另一个是圆叶目的带科和膜壳科。在后一进化支里,有三个进化支,一个是带科的棘球属;另一个是带科的带属和膜壳科的膜壳属。带属是明显聚成一类,多头带绦虫与猪带绦虫有较近的亲缘关系,泡状带绦虫和带状带绦虫与肥头绦虫有较近的亲缘关系。三种进化树与形态学分类结果完全一致。多头带绦虫、泡状带绦虫、带状带绦虫mtDNA全序列在世界上的首次测定,不仅在国际上丰富了绦虫线粒体基因组的研究内容,不仅具有重要的学术意义,而且在研究寄生虫分子分类学、种群遗传结构以及寄生虫防控等方面都有重要的意义。

全文目录

摘要  4-6
英文摘要  6-12
第一章绦虫线粒体基因组研究进展  12-18
  1 绦虫mtDNA  12-15
    1.1 一般特征  12-13
    1.2 基因的排列次序  13-14
    1.3 核苷酸的组成特点和遗传密码的使用  14
    1.4 tRNA与rRNA  14-15
    1.5 非编码区  15
  2 研究线粒体基因组的意义  15-16
    2.1 线粒体基因组的进化  15-16
      2.1.1 线粒体起源的研究  15
      2.1.2 线粒体DNA在绦虫系统发生学和群体遗传学的研究  15-16
    2.2 线粒体DNA的突变与疾病、细胞衰老和细胞凋亡  16
    2.3 线粒体DNA在绦虫种类鉴别以及分子分类学方面的应用  16
  3 结语与展望  16-18
第二章犬猫带绦虫线粒体基因组学研究  18-45
  第一节犬猫带绦虫线粒体cox1和nad4基因多态性研究  18-29
    前言  18
    1 材料与方法  18-24
      1.1 虫体样品  18-19
      1.2 仪器和试剂  19-20
        1.2.1 主要仪器  19
        1.2.2 试剂和酶  19-20
      1.3.溶液的配制  20-21
        1.3.1 溶液的配制  20
        1.3.2 培养基的配制  20
        1.3.3 感受态细胞  20-21
      1.4 虫体总DNA的提取  21
      1.5 线粒体DNA二个基因片段的PCR扩增  21-24
        1.5.1 cox1基因片段的PCR扩增  21-22
        1.5.2 nad4基因片段的PCR扩增  22-23
        1.5.3 PCR产物的纯化和连接  23
        1.5.4 重组质粒的转化及菌落PCR鉴定  23-24
      1.6 DNA序列分析  24
    2 结果与分析  24-27
      2.1 PCR扩增结果  24-25
      2.2 DNA测序结果  25
      2.3 DNA序列分析结果  25-26
      2.4 cox1和nad4基因序列系统发生树  26-27
    3 讨论  27-29
  第二节犬猫带绦虫线粒体基因组全序列测序及序列分析  29-45
    前言  29
    1 材料与方法  29-32
      1.1 虫体样品  29
      1.2 仪器和试剂  29
      1.3 方法  29-32
        1.3.1 样品TM,TH和TT的cox1、nad4部分序列的扩增及测序  29
        1.3.2 长PCR扩增引物的设计和合成  29-30
        1.3.3 长PCR扩增条件  30-31
        1.3.4 PCR产物的回收与纯化  31
        1.3.5 测序和序列分析  31
        1.3.6 线粒体基因组序列和结构分析方法  31-32
        1.3.7 基于线粒体基因组的绦虫系统发育重建  32
    2 结果与分析  32-42
      2.1 长PCR扩增结果  32-33
      2.2 测序结果和序列分析  33-42
        2.2.1 测序结果、序列拼接和比较  33
        2.2.2 三种带绦虫线粒体基因组总的特征  33-35
        2.2.3 蛋白质编码基因和密码子使用模式  35-37
        2.2.4 转移RNA(tRNA)基因  37-40
        2.2.5 核糖体RNA(rRNA)基因  40
        2.2.6 非编码区  40-41
        2.2.7 基于线粒体基因组的绦虫系统发育分析  41-42
    3 讨论  42-45
      3.1 线粒体全基因组的长PCR扩增和测序  42-43
      3.2 线粒体DNA全基因组在绦虫系统发育关系研究  43
      3.3 线粒体DNA全基因组在绦虫系统发育关系研究  43-45
全文总结  45-46
参考文献  46-53
本论文常用英文缩写  53-55
致谢  55-56
个人简历  56-57
附录A  57-58
附录B  58-59
附录C  59-71

犬猫带绦虫线粒体基因组学研究

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