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卡拉胶诱导结肠上皮细胞免疫响应的信号机制研究

作　者: 章璐
导　师: 陈海敏; 严小军
学　校: 宁波大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 卡拉胶人结肠上皮细胞细胞因子信号机制炎症
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

卡拉胶是一类来源自海洋红藻的硫酸多糖，具有优良的生物学活性和理化特性，被广泛应用于食品和医药等领域。近年来，随着卡拉胶使用量的增加，其安全性问题也随之产生。大量研究发现长期食用卡拉胶，会导致动物产生结肠溃疡，但也有不同观点认为，卡拉胶是安全的，不会引发炎症产生。由上可见，阐明卡拉胶是否具有致炎作用的关键是明确其作用机制，因此本文以结肠上皮细胞（Caco-2和HT-29细胞）以及共培养模型（Caco-2和THP-1细胞）研究卡拉胶诱导结肠上皮细胞免疫响应的信号机制，并对其安全性进行评估。卡拉胶主要有λ-，κ-和ι-型三种类型。本实验以九种卡拉胶为研究对象，分别为λ原，κ原和ι原（未降解卡拉胶）；λ10-40kd，κ10-40kd和ι10-40kd(分子量范围在10-40KD降解卡拉胶)；λ<5000，κ<5000和ι<5000（分子量小于5000降解卡拉胶）。MTT比色法显示卡拉胶在浓度小于等于10μg/mL时，对Caco-2细胞和HT-29细胞体外增殖的抑制作用很弱，高浓度（1mg/mL）的λ-10-40kd和κ<5000对Caco-2细胞生长产生严重的影响，可以导致Caco-2细胞大量死亡。利用CBA技术和ELISA对卡拉胶调节细胞分泌细胞因子的作用进行筛选，结果显示，九种卡拉胶样品因分子量和结构不同对结肠上皮细胞的调节作用而不同，且同一种卡拉胶作用效果存在细胞种类的差异性。其中以κ原的作用最强，结肠上皮细胞分泌IL-8的量与浓度呈正比。当作用浓度升高到40μg/ml时，IL-8量达到最高点，与空白相比Caco-2细胞分泌量增加到2.5倍，HT-29细胞达到6倍以上。另外，κ原还可以加强LPS诱导HT-29细胞分泌IL-8的作用。Western Blotting结果显示，TLR4受体和NF-κB表达量随着κ原作用浓度的升高而增加，当浓度升高到40μg/mL时达到最大值。EMSA检测发现κ原可使结肠上皮细胞的NF-κB出现入核现象。在Caco-2细胞中，TLR4受体抑制剂和NF-κB抑制剂可以完全消除κ原的作用，但它们不能消除在HT-29细胞中的作用。HT-29细胞中存在多信号途径，检测到MAPKs信号途径中p-ERK1/2，p-p38和p-JNK2随着κ原的作用浓度的增加而增加，并检测到AP-1入核现象。抑制剂阻断MAPKs信号通路，并不能完全消除κ原的作用。荧光标记实验显示，κ原与细胞的结合位点在细胞膜上，同样作用浓度的Flu-κ原在HT-29上结合的荧光强于Caco-2细胞。以肠上皮细胞-免疫细胞的共培养模型研究κ卡拉胶对结肠的损伤作用，结果显示，非常低浓度（≦10μg/mL）的κ卡拉胶就能诱导Caco-2细胞的凋亡，破坏上层细胞层的完整性，并使共培养模型中的细胞因子出现过度分泌。TNF-α受体的抑制剂TNF-R1能减少κ卡拉胶的作用，减少细胞的凋亡率和细胞因子IL-1β和IL-6的分泌量。因此，TNF-α因子是共培养模型中起到细胞之间交流的信号因子，能加强κ卡拉胶的作用。综上所述，λ-10-40kd和κ<5000能明显抑制Caco-2细胞的生长，可以作为抗肿瘤药物进行深入研究。九种卡拉胶诱导结肠上皮细胞免疫响应随结构和分子量的不同而不同，不存在明显的构效关系，其中以κ原的作用最强，且能促进脂多糖（LPS）对HT-29细胞分泌IL-8的作用。κ原作用机制在Caco-2细胞中是TLR4-NF-κB-IL-8信号途径，而在HT-29还存在其它信号机制，MAPKs信号通路与IL-8分泌相关，细胞膜上可能还存在其它受体。κ卡拉胶被机体摄入具有潜在导致肠道炎症产生的危险性，一方面可以通过诱导肠道TLR4的表达，加强LPS的作用，间接诱导炎症的产生；另一方面κ卡拉胶能对结肠产生损伤作用，通过破坏肠上皮细胞层的完整性，与巨噬细胞相互作用，放大免疫反应，最终导致肠道炎症的发生。因此，把κ卡拉胶作为食品添加剂的使用有一定的危害性。

全文目录

论文摘要  4-6
Abstract  6-10
引言  10-11
第一章绪论  11-21
  1 卡拉胶结构与功能  11-12
    1.1 卡拉胶结构特点  11-12
    1.2 卡拉胶的主要性质  12
  2 卡拉胶的应用和研究现状  12-14
    2.1 卡拉胶在食品工业中的应用  12-13
    2.2 卡拉胶在医药中的应用  13
    2.3 卡拉胶的安全研究  13-14
    2.4 卡拉胶与 Toll 样受体的关系  14
  3 Tolls 受体在免疫中的作用  14-20
    3.1 TLR 结构与分布[33]  15-16
    3.2 TLR 在天然免疫和获得性免疫中的作用  16-17
    3.3 TLR 与某些疾病的关系  17-20
      3.3.1 TLRs 在 IBD 病中的作用  17-18
      3.3.2 TLRs 在动脉样硬化（AS）中的作用  18
      3.3.3 TLRs 在败血症中的作用  18-19
      3.3.4 其他相关研究  19
      3.3.5 TLRs 在疾病防御和治疗中的作用  19-20
  4 展望  20-21
第二章以结肠上皮细胞研究卡拉胶的天然免疫作用  21-39
  1 材料与方法  21-24
    1.1 材料  21-22
    1.2 实验方法  22-24
      1.2.1 细胞培养  22
      1.2.2 制备卡拉胶  22
      1.2.3 MTT 法检测细胞存活率  22
      1.2.4 Hoechst 细胞核染色和细胞形态观察  22
      1.2.5 电镜检测细胞内变化  22-23
      1.2.6 CBA 技术检测多种免疫因子的变化  23
      1.2.7 ELISA 检测细胞分泌 IL-8 的变化  23
      1.2.8 Western Blotting 分析免疫信号通路  23
      1.2.9 EMSA 分析核转录因子进核情况  23-24
      1.2.10 荧光标记κ原  24
      1.2.11 统计分析  24
  2 结果  24-34
    2.1 卡拉胶对结肠上皮细胞体外增殖的抑制作用  24-26
    2.2 卡拉胶对 Caco-2 细胞的损伤研究  26-27
    2.3 不同卡拉胶对结肠上皮细胞分泌免疫因子的影响  27-28
    2.4 不同浓度κ卡拉胶对结肠上皮细胞分泌 IL-8 的影响  28-29
    2.5 天然免疫调节信号通路研究  29-34
      2.5.1 卡拉胶对天然免疫中相关蛋白表达的影响  29-31
      2.5.2 κ原对核转录因子入核的影响  31-32
      2.5.3 抑制剂阻断信号通路对κ原免疫调节作用的影响  32-33
      2.5.4 Flu-κ原与结肠上皮细胞结合位点  33-34
  3 讨论  34-39
第三章以肠上皮细胞-免疫细胞的共培养模型研究卡拉胶对结肠的损伤作用  39-50
  1 材料与方法  39-41
    1.1 实验材料  39-40
    1.2 实验方法  40-41
      1.2.1 细胞培养  40
      1.2.2 MTT 法检测细胞毒  40
      1.2.3 CBA 技术检测κ卡拉胶对细胞分泌细胞因子的影响  40
      1.2.4 共培养模型实验  40-41
      1.2.5 统计分析  41
  2 结果  41-47
    2.1 卡拉胶对分化后细胞生长的影响  41-42
    2.2 卡拉胶对成膜后 Caco-2 细胞分泌细胞因子的影响  42-43
    2.3 κ卡拉胶刺激共培养模型后细胞分泌因子的变化  43-44
    2.4 研究κ卡拉胶诱导共培养模型分泌细胞因子的原因  44-47
      2.4.1 κ卡拉胶对共培养模型上层 Caco-2 细胞的损伤作用  44-46
      2.4.2 共培养模型中细胞之间的信号交流  46-47
  3 讨论  47-50
第四章结论  50-51
参考文献  51-58
在学研究成果  58-59
致谢  59

卡拉胶诱导结肠上皮细胞免疫响应的信号机制研究

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