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局部应用鞘氨醇-1-磷酸受体调节剂抑制小鼠异基因角膜移植排斥的研究

作　者: 刘勇
导　师: 黄一飞
学　校: 中国人民解放军军医进修学院
专　业: 眼科学
关键词: 鞘氨醇-1磷酸受体调节剂 FTY720 FTY720-P 角膜移植 CD4+T细胞调节性T细胞效应T细胞细胞因子
分类号: R779.65
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

目的：通过将鞘氨醇-1-磷酸(S1P)受体调节剂 FTY720眼用凝胶应用于小鼠异基因角膜移植模型中，观察FTY720眼用凝胶抑制小鼠角膜移植排斥的情况，并与临床常用的眼用免疫抑制剂环孢霉素A（CsA）进行比较。最终明确FTY720眼用凝胶抑制小鼠角膜移植的排斥反应的效果。通过流式细胞学、Realtime-PCR、Elisa、常规病理以及免疫组化方法对不同处理组小鼠的角膜、外周血、脾脏及颈部淋巴结标本进行检测；以探索FTY720眼用凝胶局部点眼抑制小鼠异基因角膜移植排斥的作用机制。使用磁珠分选法分选出具有免疫调节功能的小鼠调节性T细胞，并将分选细胞分别与S1P受体调节剂（FTY720及FTY720-P）共培养。通过CCK-8法检测共培养的调节性T细胞增殖情况，以及混合淋巴反应结果；以确定S1P受体调节剂直接作用于调节性T细胞后的细胞增殖及免疫功能变化情况。通过Elisa法检测共培养体系中与细胞功能相关的细胞因子(IL-10和TGF-β1)水平；Realtime-PCR法了解共培养细胞中相应细胞因子mRNA的表达情况。最终以探索出S1P受体调剂直接作用于小鼠调节性T细胞后，其功能及表型发生变化的的机制。方法：1.制备0.1%、0.3%及0.5%三个浓度S1P受体调节剂FTY720温度敏感型眼用凝胶。2.取45雄性BALB/C小鼠随机分为5组（空白对照组、低浓度、中浓度、高浓度FTY720眼用凝胶组以及1%环孢霉素眼液组），每只小鼠随机选取一眼作为受体眼，分别接受雄性C57BL/6小鼠角膜植片，进行异基因穿透性角膜移植。术后即分别给予相应方案处置，术后10-11天拆除角膜缝线；一月内显微镜下观察并记录全部小鼠的角膜植片情况。至小鼠角膜发生排斥及观察结束后处死实验动物。3.取30只雄性BALB/C小鼠同上随机分为5组，每只小鼠随机一眼作为受体眼，分别接受雄性C57BL/6小鼠角膜植片，进行异基因穿透性角膜移植。术后分别给予上述方案分组方案处置，术后10-11天拆除角膜缝线。术后14天时处死小鼠，分别进行实验室检查。其中取颈部引流淋巴结、外周血、脾脏进行流式细胞学检查，了解CD4+T细胞及CD4+CD25+Foxp3+T细胞的分布情况。对外周血的标本使用Elisa法检测外周血清中IL-2、IL-10、IFN-γ及TGF-β1的含量。每组取3只小鼠角膜分别采用RealtimePCR法检测角膜植片中IL-2、IL-10、IFN-γ、TGF-β1及Foxp3mRNA表达情况。每组另取3只小鼠角膜分别进行常规HE染色，了解角膜排斥反应情况；并对CD4+T细胞以及细胞因子IL-2、IL-10、IFN-γ及TGF-β1进行免疫组化检查，了解CD4+T细胞在角膜植片浸润情况以及上述有关细胞因子在角膜植片中含量的变化。4.取30只雄性BALB/C小鼠；处死后应用免疫磁珠分选法将脾脏中的CD4+CD25+以及CD4+CD25-T细胞分选出来。对分选后的细胞采用流式细胞技术明确分选效率。5.对分选的细胞应用CD3、CD28单抗联合IL-2共同体外培养5天，充分激活上述分选细胞。6.在激活的CD4+CD25+T细胞培养体系中分别加入10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml的FTY720以及FTY720-P，空白对照组加入10ulDMSO；继续共培养48小时。CCK-8法检测CD4+CD25+T细胞加入S1P受体调节剂前后细胞增殖情况（共计5天，第0天为加入S1P受体调节剂时、第1天及2天为加入S1P受体调节剂后时刻，第3及4天为洗涤上述细胞后继续原培养条件进行培养的时刻）。7.加入不同药物后的48小时后，取共培养后的CD4+CD25+T细胞（调节性T细胞、Treg）与CD4+CD25-T细胞（效应T细胞、Teff）按不同比例进行混合淋巴细胞培养，5天后CCK-8法检测Teff细胞增殖情况。8.加入不同药物后的48小时后，取共培养CD4+CD25+T细胞上清液进行Elisa检测，检测IL-10、TGF-β1含量；从上述共培养细胞中提取总RNA，Realtime-PCR检测IL-10、TGF-β1及Foxp3mRNA的表达情况。结果：1.成功制备0.1%、0.3%及0.5%三个浓度S1P受体调节剂FTY720温度敏感型眼用凝胶。其在室温环境下为液态，在近体温状态时迅速变为胶冻状。2.观察45只小鼠术后角膜植片情况，植片平均生存时间（MST）方面，0.5%FTY720组(24.11±1.58天)以及1%CsA组(25.00±1.91天)均较空白对照组（13.44±0.48天）明显延长(P<0.01)。3.0.5%FTY720能显著增加颈部淋巴结中CD4+T细胞以及Treg细胞的比例(P<0.05和P<0.01)。在0.5%FTY720组，角膜植片中TGF-β1mRNA表达明显增高(p<0.05),而在1%CsA组角膜植片中IL-2和IFN-γmRNA则明显降低的(p<0.01和p<0.05)。免疫组化染色结果证实角膜植片中上述细胞因子含量变化情况与相应mRNA表达基本一致。此外0.5%FTY720以及1%CsA点眼后，角膜植片中CD4+T细胞的浸润明显减少。4.全部各组小鼠外周血清中IL-2、IL-10、IFN-γ及TGF-β1含量未见变化。5.自小鼠脾脏细胞中成功分选CD4+CD25+T细胞，流式细胞检测结果显示CD4+CD25+T细胞的分选效率在93%以上，分选出细胞中Foxp3+比例在94%以上。CD4+CD25-T细胞分选率接近96%其Foxp3+比例仅为1.45%左右。6.对上述分选出的细胞应用CD3、CD28单抗联合IL-2共同体外培养5天后，上述细胞被充分激活。7.对激活的的CD4+CD25+T细胞分别给予三个不同剂量的FTY720及FTY720-P共培养后，经过CCK-8检测后发现与空白对照组比较，给予S1P受体调节剂后CD4+CD25+T细胞的增殖活性未见变化（P>0.05）。8.共培养的Treg细胞与Teff细胞进行混合淋巴细胞培养5天后，结果显示在Treg:Teff为1:1时，高剂量FTY720、中等剂量及高剂量的FTY720-P组中Teff细胞增殖能力被明显抑制（P<0.05）；在Treg:Teff为1:4时，仅有高剂量的FTY720-P组中Teff细胞增殖能力被抑制（P<0.05）；而在Treg:Teff为1:8时，各组之间未见显著性差异（P>0.05）。9.共培养48小时后，取共培养CD4+CD25+T细胞上清液进行Elisa检测。结果显示检测各组中IL-10含量未见变化；对于TGF-β1含量，在高剂量FTY720组、中等剂量和高剂量FTY720-P组的含量均显著高于对照组（P<0.05）。对上述共培养细胞进行RealtimePCR检测，结果显示三个剂量FTY720组细胞中IL-10、TGF-β1及Foxp3mRNA水平未见显著变化；而在高剂量FTY720-P组细胞中TGF-β1及Foxp3mRNA的表达明显增高（P<0.05）。结论：1.0.5%FTY720眼用凝胶以及1%CsA眼液均能够显著延长异基因小鼠角膜移植术后免疫排斥反应的发生时间。2.0.5%FTY720眼用凝胶能够增加颈部引流淋巴结中的CD4+T细胞的比率，且更为显著地增加了Treg细胞在局部淋巴结中的比率。0.5%FTY720能够增加角膜植片中TGF-β1mRNA及其蛋白的表达；并且能够减少CD4+T细胞在角膜植片中的浸润。3.1%CsA眼液也能够显著减少CD4+T细胞在角膜植片中的浸润；但是与0.5%FTY720眼用凝胶不同，其角膜植片中IL-2及IFN-γ的含量显著减少。4.各组血清中有关细胞因子的含量未见变化（局部点眼剂型未能影响到外周血中细胞因子的含量）。5.三个浓度的FTY720及FTY720-P均不能影响共培养Treg细胞的增殖能力。6.高剂量FTY720、中等及高剂量的FTY720-P能够显著增加共培养Treg细胞针对Teff细胞的抑制能力。其作用机制为增加了共培养细胞中CD25+及Foxp3+表型的比例，并且上调了共培养细胞中TGF-β1mRNA及相应蛋白的表达；此外高剂量FTY720-P也能够增加共培养Treg细胞中Foxp3mRNA表达。

全文目录

英文缩略词表  6-8
中文摘要  8-12
Abstract  12-16
前言  16-21
第一部分鞘氨醇-1-磷酸受体调节剂 FTY720 眼用凝胶抑制小鼠异基因角膜移植排斥的药效学观察  21-31
  引言  21
  材料和方法  21-23
    1.1.1 实验动物  21
    1.1.2 主要器械及仪器  21
    1.1.3 实验试剂  21-22
    1.1.4 手术操作  22
    1.1.5 术后处置及观察  22-23
    1.1.6 角膜植片排斥标准  23
    1.1.7 统计学分析  23
  结果  23-27
    1.2.1 成功配制FTY720 温度敏感型眼用凝胶  23-24
    1.2.2 小鼠术后角膜移植排斥时间  24-25
    1.2.3 各组观察期结束时角膜植片图像  25-27
  讨论  27-30
  小结  30-31
第二部分鞘氨醇-1-磷酸受体调节剂FTY720 眼用凝胶抑制小鼠异基因角膜移植排斥的机制研究  31-69
  引言  31
  材料和方法  31-40
    2.1.1 实验动物  31
    2.1.2 主要器械及仪器  31-32
    2.1.3 实验试剂  32-33
    2.1.4 手术操作  33-34
    2.1.5 术后处置  34
    2.1.6 流式细胞学检测  34-35
    2.1.7 Elisa法检测外周血清中细胞因子水平  35-36
    2.1.8 Realtime-PCR检测小鼠角膜植片中细胞因子mRNA表达  36-38
    2.1.9 角膜植片组织病理学染色  38-40
    2.1.10 统计学分析  40
  结果  40-63
    2.2.1 流式细胞学结果  40-47
    2.2.2 Elisa检查结果  47-49
    2.2.3 Realtime-PCR结果  49-52
    2.2.4 植片病理学检查结果  52-63
  讨论  63-68
  小结  68-69
第三部分鞘氨醇-1-磷酸受体调节剂对小鼠CD4+CD25+调节性T细胞免疫功能影响的研究  69-98
  引言  69
  材料和方法  69-77
    3.1.1 实验动物  69
    3.1.2 主要器械及仪器  69-70
    3.1.3 实验试剂  70-71
    3.1.4 实验操作  71-77
    3.1.5 统计学分析  77
  结果  77-93
    3.2.1 分选CD4+CD25+T细胞以及CD4+CD25-T细胞情况  77-80
    3.2.2 CD4+CD25+T/CD4+CD25-T细胞激活  80
    3.2.3 共培养CD4+CD25+T细胞增殖情况  80-81
    3.2.4 CD4+CD25+T（Treg）细胞与CD4+CD25-T(Teff) 细胞混合培养结果  81-82
    3.2.5 共同培养CD4+CD25+T细胞表型变化情况  82-87
    3.2.6 共同培养CD4+CD25+T细胞上清液中细胞因子含量变化情况  87-90
    3.2.7 共同培养CD4+CD25+T细胞中细胞因子mRNA含量变化情况  90-93
  讨论  93-97
  小结  97-98
结论  98-100
参考文献  100-108
文献综述鞘氨醇 1-磷酸受体调节剂的免疫调节功能及在眼科应用  108-117
  参考文献  113-117
就读期间发表文章  117-119
致谢  119-120

局部应用鞘氨醇-1-磷酸受体调节剂抑制小鼠异基因角膜移植排斥的研究

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