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hTERT非端粒酶依赖途径调控喉鳞癌细胞凋亡的研究

作　者: 盛建飞
导　师: 陶泽璋
学　校: 武汉大学
专　业: 耳鼻咽喉头颈外科学
关键词: 人端粒酶逆转录酶前列腺凋亡反应因子喉鳞癌细胞细胞凋亡
分类号: R739.65
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

目的：应用RNA干扰技术沉默人端粒酶逆转录酶(hTERT)前后,检测喉癌细胞及移植瘤组织中hTERT表达含量与端粒酶活性及前列腺凋亡反应因子(Par-4)表达相关性,探讨人端粒酶逆转录酶不依赖其催化活性的抗凋亡作用及其机制,为喉癌的基因治疗提供新的思路。方法：构建靶向人端粒酶逆转录酶mRNA的质粒p-EGFP-shTERT,将质粒转染体外培养的喉癌Hep-2细胞,应用TRAP-PCR法检测检测转染后0h、12h、24h、48h四个时间点喉癌Hep-2细胞端粒酶活性,流式细胞术检测转染后四个时间点细胞凋亡程度,Western-blot检测hTERT蛋白及Par-4蛋白表达；建立喉癌移植瘤裸鼠动物模型,采用瘤体内多点注射方式将质粒p-EGFP-shTERT导入移植瘤内,采用量子点超敏荧光免疫技术检测质粒转染前以及转染后6d、10d、14d移植瘤组织内hTERT和Par-4两种蛋白表达情况,方差分析、卡方检验及Spearman相关性检验分析实验结果。结果：质粒成功转染Hep-2细胞24h后端粒酶活性开始下降,48h后端粒酶活性被抑制；质粒转染12h后Hep-2细胞即有显著凋亡,随时间延长,凋亡率逐渐增高；hTERT蛋白表达随转染时间延长逐渐降低,Par-4蛋白表达逐渐增加；体内实验中发现,质粒转染前,hTERT蛋白在喉癌Hep-2细胞裸鼠移植瘤中呈高表达,而且胞核、胞浆内均有表达,但Par-4蛋白仅在胞浆表达,质粒转染14天后,hTERT表达降低,胞核内表达下调明显,而Par-4在胞核表达增多,Speraman等级相关分析发现,移植瘤中Par-4和hTERT在质粒p-EGFP-shTERT转染前后表达呈负相关(p<0.05,r=-0.908)。结论：应用RNA干扰抑制hTERT表达过程中,我们发现质粒转染24h后,端粒酶活性仅有轻度降低,48小时后端粒酶活性才被抑制,然而质粒转染Hep-2细胞12h后,就有凋亡反应出现,24h后凋亡显著,因此推测,RNA干扰抑制hTERT诱导的凋亡反应并不依赖端粒酶活性的抑制。同样,hTERT介导的肿瘤细胞抗凋亡作用除端粒酶激活途径外,还存在其它非端粒酶途径；抑制hTERT蛋白表达的同时,我们还发现,前列腺凋亡反应因子(Par-4)表达上调,且质粒转染前后两种蛋白表达部位发生改变,提示Par-4可能参与hTERT不依赖其催化活性的抗凋亡途径,hTERT可能在胞浆中与Par-4相互作用,抑制了Par-4转入胞核,从而抑制了细胞凋亡。

全文目录

中文摘要  7-8
Abstract  8-11
引言  11-13
第一部分 hTERT非端粒酶途径调控细胞凋亡硏究  13-29
  前言  13
  材料  13-16
  方法  16-23
  结果  23-27
  讨论  27-28
  结论  28-29
第二部分 Par-4在hTERT非端粒酶途径调控细胞凋亡中的机制  29-38
  前言  29-30
  材料  30-31
  方法  31-34
  结果  34-37
  讨论  37
  结论  37-38
参考文献  38-41
综述  41-56
  参考文献  52-56
攻博期间发表的科研成果目录  56-57
致谢  57

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