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人乳腺癌耐药细胞株的建立及其耐药机制研究

作　者: 李文静
导　师: 赵建华
学　校: 南京医科大学
专　业: 临床检验诊断学
关键词: 乳腺癌细胞多西紫杉醇阿霉素多药耐药通路
分类号: R737.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

目的建立人乳腺癌多西紫杉醇(Docetaxel，Doc)、阿霉素(Adriamycin，Adr)耐药细胞模型，描述两者生物学特性，探讨其获得性耐药的潜在分子机制；应用miRNA（微小RNA）微阵列技术筛选人乳腺癌多西紫杉醇耐药株、阿霉素耐药株及亲本细胞间的miRNA差异表达谱，并通过实时荧光定量PCR (RT-qPCR)进行确认，为进一步研究miRNA调控在耐药形成中的作用奠定基础。方法1.以人乳腺癌敏感细胞MCF-7为亲本细胞(MCF-7/S)，在体外采用低浓度逐步加量诱导法，分别建立多西紫杉醇耐药细胞株(MCF-7/Doc)和阿霉素耐药细胞株(MCF-7/Adr)；双目倒置显微镜观察并记录细胞在获得耐药性过程中的形态学变化；采用胎盼蓝细胞计数法进行生长曲线绘制和群体倍增时间测定；采用MTT法测定敏感及耐药细胞株对各种抗肿瘤药物的敏感程度；流式细胞术(FCM)检测敏感及耐药细胞株周期分布的变化；采用Western blot检测敏感及耐药细胞株表面标志雌激素受体(ER)的表达变化；RT-qPCR和Western blot检测耐药细胞株系列多药耐药相关基因如转运体MDR1/P-gp、MRP1和BCRP，代谢酶CYP3A4和GST pi，修复基因Topo IIα，以及凋亡基因Bcl-2及Bax的mRNA和蛋白的表达。2.采用miRNA微阵列分析筛选出乳腺癌敏感株、多西紫杉醇耐药株、阿霉素耐药株中差异表达的微小RNA，差异倍数≥2或≤0.5被认为有统计学意义；应用RT-qPCR对其中15个在MCF-7/Doc及MCF-7/Adr中均上调或下调的miRNAs进行验证。结果1.经16个月的诱导，建立的MCF-7/Doc可在含200nM Doc培养液中稳定生长。光镜下观察，经多西紫杉醇处理后诱导中的细胞变圆、变小、凸起、核分裂像减少；MTT显示，MCF-7/Doc耐药指数为敏感细胞MCF-7/S的37倍，对其他多种化疗药物呈不同程度的交叉耐药状态。MCF-7/Doc倍增时间较MCF-7/S延长(41.6h vs30.6h；P<0.01)。与亲本MCF-7/S相比，耐药细胞处于G1期和G2期的细胞增加，S期减少；MDR1/P-gp、MRP1、BCRP、CYP3A4、Bcl-2基因和蛋白表达水平上调，Topo IIα及Bax基因和蛋白表达下调，而ER阳性表达丢失。2.经16个月的诱导，建立的MCF-7/Adr可在含1500nM Adr培养液中稳定生长。光镜下观察，经阿霉素处理后诱导中的细胞变大、胞核肿胀、颗粒感明显、核分裂像减少；MTT显示，MCF-7/Adr耐药指数为亲代敏感细胞MCF-7/S的274倍，对其他多种化疗药物呈不同程度的交叉耐药状态。MCF-7/Adr倍增时间较MCF-7/S延长(33.8h vs30.6h；P<0.05)。与亲本MCF-7/S相比，耐药细胞处于G1期和G2期的细胞增加，S期减少；MDR1/P-gp、MRP1、BCRP、GST pi、Bcl-2基因和蛋白表达水平上调，Topo IIα及Bax基因和蛋白表达下调，而ER阳性表达丢失。3. MiRNA微阵列结果显示：与亲本MCF-7/S相比，多西紫杉醇耐药株中33个miRNAs上调，53个下调；阿霉素耐药株中84个miRNAs上调，100个下调；其中在两种耐药株中均上调的miRNAs有11个，均下调的有27个。两种耐药株之间进行比较，也有165个miRNAs存在着表达差异。挑选15个在两株耐药细胞中有一致性改变的miRNAs，其RT-qPCR验证结果与芯片结果相符合。结论1.建立的MCF-7/Doc、MCF-7/Adr耐药细胞株具有典型的多药耐药特性，可用于耐药机制的研究。2. MCF-7/S获得性多西紫杉醇或阿霉素耐药的过程均比较复杂，涉及多个基因或多条通路。MCF-7/Doc和MCF-7/Adr耐药细胞，既存在着部分共同的、也存在着各自药物所特有的诱发机制。3. MCF-7/S、MCF-7/Doc和MCF-7/Adr细胞间存在着明显的miRNA表达差异，提示miRNA可能在耐药获得中有重要调控作用，值得进一步研究。

全文目录

摘要  6-9
Abstract  9-12
前言  12-14
第一部分人乳腺癌多西紫杉醇和阿霉素耐药细胞株的建立及生物学特性  14-42
  1 背景  14-15
  2 材料  15-20
  3 方法  20-28
  4 结果  28-37
  5 讨论  37-42
第二部分人乳腺癌耐药细胞株差异表达 miRNA 的筛选研究  42-58
  1 背景  42
  2 材料  42-44
  3 方法  44-48
  4 结果  48-55
  5 讨论  55-58
总结与展望  58-60
参考文献  60-65
综述  65-75
  参考文献  71-75
英文缩略词表  75-76
攻读学位期间发表文章情况  76-77
致谢  77

人乳腺癌耐药细胞株的建立及其耐药机制研究

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