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TRPC1参与氯化镉诱导人胚肾细胞凋亡的研究

作　者: 余少珍
导　师: 邹飞
学　校: 南方医科大学
专　业: 劳动卫生与环境卫生学
关键词: TRPC1 氯化镉人胚肾细胞细胞凋亡
分类号: R595.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

研究背景镉(Cadmium)是一种有色重金属,它与氧、氯、硫等化学元素形成无机化合物分布于自然界中。镉可以蓄积在植物和动物的体内,并可以通过食物链进入人体,并且在体内缓慢积累。随着工业的迅速发展.镉的生产和使用不断增加,受污染环境中的镉含量也逐年上升。环境中的重金属镉的含量越来越高,其毒性危害之大已经引起人们的普遍重视。镉已被美国国家毒理学计划列为人类致癌物。在现代化工业和科技的飞速发展,镉污染问题已经恶化,并且很显然镉对人体有潜在危害。但到目前为止,慢性镉中毒尚无有效的治疗方法。因此,探索镉中毒的预防和治疗药物就显得尤为重要。镉影响多种细胞活动,比如凋亡,增殖,分化等。细胞凋亡是细胞死亡的基本形式,在多细胞有机体的动态平衡中起着至关重要的作用。钙离子信号通路在许多细胞活动,包括神经分泌,骨骼肌肉收缩,细胞生长和分化中起着重要的作用。另一方面,细胞在外源性和／或内源性因素刺激下,细胞内钙稳态维护细胞正常功能也是非常重要的。因此,研究证明不同细胞内钙浓度变化可诱导细胞凋亡,并且越来越多的证据支持在细胞凋亡进程的早期和晚期阶段：增加细胞内钙离子浓度可以导致细胞凋亡有研究者通过体内和体外实验表明当镉浓度高于5.0μM时,镉可诱导许多组织和器官诱导细胞凋亡,比如肾,肺,睾丸和肝脏。虽然镉诱导的不同细胞类型的细胞毒性和细胞凋亡的研究较多,但确切研究机制尚不清楚。有研究表明镉可在不同层次干扰细胞内钙稳态,也有研究显示镉诱导不同类型细胞的细胞凋亡,是通过增加细胞内钙离子浓度诱导细胞凋亡。现在有越来越多的证据表明,瞬时受体电位(TRPC)通道参与钙离子内流的途径,它被认为是一个重要的细胞内钙离子稳态调节的离子通道；TRPC1可参与非常重要的细胞进程,如细胞增殖和凋亡。然而,TRPC1参与镉诱导人胚肾细胞凋亡仍然不明确。并且镉诱导细胞凋亡的详细机制仍然知之甚少,因此,我们在此研究首次揭示TRPC1在镉诱导人胚肾细胞凋亡中发挥的关键作用。目的本研究通过构建氯化镉(CdCl2)诱导人胚肾细胞(HEK293)凋亡的模型,在此模型基础上探讨TRPC1参与氯化镉诱导人胚肾细胞HEK293凋亡过程及其机制以期为镉中毒的研究和预防控制提供新思路。方法1：通过流式细胞仪检测不同浓度的CdCl2作用HEK293细胞6h后细胞凋亡的情况,以建立CdCl2诱导人胚肾细胞HEK293细胞凋亡的模型。2：通过RT-PCR检测人胚肾细胞HEK293的TRPC通道亚型的表达情况。3：通过脂质体转染TRPC1质粒,分别用RT-PCR和Western Blot检测TRPC1mRNA和蛋白水平的变化,采用流式细胞仪观察细胞凋亡情况,观察上调TRPC1的表达对CdCl2诱导人胚肾细胞HEK293细胞凋亡的影响。4：通过流式细胞仪检测CdCl2对人胚肾细胞HEK293细胞周期的影响。5：采用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)检测加入不同浓度CdCl2后人胚肾细胞HEK293细胞内镉离子的含量。6：通过过表达上调TRPC1的表达,采用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)检测加入CdCl2后人胚肾细胞HEK293细胞内镉离子的含量。7：使用激光共聚焦显微镜,观察正常人胚肾细胞HEK293加入CdCl2时细胞内钙离子动态变化。8：通过过表达上调TRPC1,使用激光共聚焦显微镜,观察加入氯化镉后人胚肾细胞HEK293胞内钙离子实时动态变化。结果1. CdCl2可诱导人胚肾细胞HEK293凋亡不同浓度CdCl2处理人胚肾细胞HEK2936小时后,用流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果显示,浓度在15μM以上的CdCl2处理6小时后细胞凋亡率与对照组相比明显升高并且具有统计学意义(P<0.001)。用30μMCdCl2作用人胚肾细胞HEK293不同时间后,采用蛋白印迹法检测相关蛋白PARP切割片段,结果显示,6小时后切割PARP明显升高。用hoechst33342染色方法检测CdCl2处理人胚肾细胞HEK293后细胞核形态变化。结果显示30μMCdCl2作用人胚肾细胞HEK2936小时后,HEK293细胞核出现明显的核浓缩、染色质片段等细胞凋亡的特征性表现,并形成典型的凋亡小体。以上结果表明,CdCl2可诱导人胚肾细胞HEK293凋亡,并具有剂量和时间反应关系。2.正常的HEK293细胞表达六个TRPC通道亚型正常条件下,人胚肾细胞HEK293细胞的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析,检测到六个单一条带,大小为168bp、112bp、119bp、159bp、145bp、103bp(与预期的产物大小一致),分别对应于TRPC1、TRPC3、TRPC4、TRPC5、TRPC6和TRPC7亚型。3. CdCl2处理HEK293细胞对TRPC1活性影响采用RT-PCR检测30μM CdCl2作用HEK293细胞6h后TRPC1、TRPC3、 TRPC4mRNA表达量的变化,验证是否对TRPC1、TRPC3、TRPC4mRNA表达有影响。结果显示:CdCl2作用HEK293细胞6h后抑制了TRPC1、TRPC3、TRPC4mRNA的表达,并且TRPC1的表达量是最高的。因此我们用免疫印迹法检测30μM CdCl2作用HEK293细胞不同时间TRPC1表达量的变化,验证CdCl2对TRPC1蛋白表达量的影响。结果显示,TRPC1蛋白的表达量随CdCl2作用时间的增加而下降,提示TRPC1可能在CdCl2诱导HEK293细胞凋亡过程发挥了作用。4.上调TRPC1表达对CdCl2诱导人胚肾细胞凋亡率的影响为了证实TRPC1是否参与CdCl2诱导人胚肾细胞的凋亡,本研究采用过表达上调TRPC1表达。结果显示,TRPC1过表达后再加入30μMCdCl2继续作用6h后可显著降低人胚肾细胞HEK293细胞凋亡率,TRPC1过表达后加CdCl2组与空质粒加CdCl2组细胞凋亡率之间差异具有统计学意义(P<0.001)；表明TRPC1过表达对CdCl2诱导人胚肾细胞凋亡过程中发挥了一定的作用,从而进一步证实TRPC1参与CdCl2诱导人胚肾细胞凋亡过程。5. CdCl2对人胚肾细胞细胞周期的影响以流式细胞术检测正常HEK293细胞加入CdCl2对细胞周期的影响。结果显示,与阴性对照组相比,加药组细胞各期细胞数量之间差异无统计学意义(P>0.05),表明HEK293细胞加入CdCl2后细胞周期无阻滞。6.检测HEK293细胞胞内Cd2+含量检测采用电感耦合等离子体质谱技术检测(?)HEK293细胞加入不同浓度CdCl2后胞内Cd2+的含量.结果显示：加入CdCl2后HEK293细胞Cd2+的含量增加且存在浓度梯度,加药组与对照组之间Cd2+的含量差异具有统计学意义(P<0.001)。采用电感耦合等离子体质谱技术检测阴性对照组(空质粒)和TRPC1过表达组加药后HEK293细胞胞内Cd2+的含量,结果显示：TRPC1过表达后加药组与空质粒加药组Cd2+的含量下降且之间差异具有统计学意义(P<0.001)。7.检测HEK293细胞胞内Ca2+含量检测HEK293细胞经fluo-4/AM染色后采用激光共聚焦检测细胞内荧光,实时监测胞内钙离子的浓度。结果显示：镉离子可以有效的诱导胞内钙离子浓度的增加。用TRPC1过表达组与空质粒组分别处理人胚肾细胞HEK29348h后,经fluo-4/AM染色后通过激光共聚焦检测细胞内荧光,实时监测胞内钙离子的浓度。结果显示：TRPC1过表达组与空质粒组相比,胞内钙离子浓度较高。结论本研究的实验结果显示,CdCl2可诱导人胚肾细胞凋亡,并且过表达TRPC1可以减少人胚肾细胞的凋亡率,说明TRPC1在CdCl2诱导人胚肾细胞凋亡过程中发挥一定作用。

全文目录

摘要  3-8
ABSTRACT  8-15
前言  15-21
材料和方法  21-38
  1. 实验材料  21-25
  2. 实验方法  25-38
结果  38-61
  1. CdCl_2可诱导人胚肾细胞HEK293凋亡  38-42
  2. 正常条件下,HEK293细胞表达六个TRPC通道亚型  42-44
  3. CdCl_2作用HEK293细胞对TRPC1活性影响  44-47
  4. 上调TRPC1表达对CdCl_2诱导人胚肾细胞凋亡率的影响  47-54
  5. CdCl_2对人胚肾细胞周期的影响  54-55
  6. 检测HEK293细胞胞内Cd~(2+)含量检测  55-58
  7. 检测HEK293细胞胞内Ca~(2+)含量检测  58-61
讨论  61-66
全文小结  66-68
参考文献  68-73
硕士期间发表论文  73-74
致谢  74-76
附件  76

TRPC1参与氯化镉诱导人胚肾细胞凋亡的研究

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