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鼠疫疫苗引起的小鼠记忆B细胞动态变化及其分子发育机制研究

作　者: 张雪璨
导　师: 王效义
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 军事预防医学
关键词: B淋巴细胞鼠疫疫苗流式细胞术 RNA-Seq
分类号: R516.8
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

鼠疫是一种传播快、发病急、传染性极强且病死率极高的自然疫源性烈性传染病。鼠疫耶尔森菌（Yersinia pestis，以下简称鼠疫菌）是其病原体。据记载，在人类历史上，世界范围内曾爆发过3次鼠疫大流行，并致使至少一亿六千万人死亡。现如今，鼠疫在全球重新进入了一个活跃期，同时其自然疫源地也在逐步扩增，人间鼠疫不断发生。而在2000年，世界卫生组织将鼠疫列为重新抬头的传染病。鼠疫菌本由o:1b血清型假结核耶尔森菌进化而来的。其广泛存在于我们的生活环境中，并可经过水或食物进行传播从而引发非致死性的肠道疾病。而在自然界中，啮齿类和蚤类作为传播媒介传播鼠疫菌，使宿主可引发全身系统性感染的致死性疾病。另外，抗生素治疗鼠疫虽然效果良好，但败血症型鼠疫与肺型鼠疫进展十分迅速，即使早期足量合理使用抗生素，病死率依然较高，且治疗鼠疫的抗生素副作用较大。而近年来世界各地陆续发现耐药鼠疫菌菌株。因此，研究鼠疫疫苗具有重要意义。传统鼠疫疫苗中灭活全菌疫苗保护时间短，而且仅对腺鼠疫有效，已被淘汰；减毒活疫苗对腺鼠疫和肺鼠疫均具有良好的保护活性，但副作用严重，目前已在许多西方国家停止使用。重组亚单位疫苗能够克服传统疫苗的许多缺陷，不含有感染性组分，无致病性，而且具有在体内不复制的优点，动物实验表明其对腺鼠疫和肺鼠疫均具有良好的免疫保护作用，因此亚单位疫苗成为当前鼠疫疫苗研究的热点。目前鼠疫亚单位疫苗的研究大多是基于F1荚膜抗原和V抗原。为了研制一种安全、高效的鼠疫亚单位疫苗，我们从鼠疫菌疫苗株中提取纯化了高纯度天然F1抗原，同时避开V抗原产生免疫抑制作用的区段，克隆表达了不带任何标签和载体序列的部分V抗原(rV270抗原)。将rV270抗原和天然F1抗原分别吸附到人可用的铝佐剂中制备了鼠疫亚单位疫苗，并经小鼠、豚鼠、兔和猕猴动物实验证明具有良好的免疫保护作用和安全性。我们在研究中发现，亚单位疫苗和EV76减毒活疫苗免疫的小鼠虽然维持较高的F1抗体滴度长达518天，但分别在免疫后56天、136天和518天三个不同时间点攻毒时均未发现F1抗体滴度有明显升高的现象，这个结果显然不符合记忆B细胞遇到相同抗原时快速、大量产生抗体的一般结论。众所周知，维持长久体液免疫反应有两种方式：第一，长寿命浆细胞通过不断产生抗体维持机体的体液免疫反应；第二，记忆B细胞不断分化出短寿命浆细胞，然后通过短寿命浆细胞分泌抗体维持体液免疫反应。因而通过鼠疫疫苗免疫小鼠后了解是否有记忆B细胞产生、记忆B细胞产生的动态变化以及记忆B细胞分化发育的分子机制，进而为新型鼠疫疫苗的设计和应用奠定基础。我们通过采用皮下注射人免疫剂量1/10的EV76减毒活疫苗和20μg/只剂量的F1亚单位疫苗免疫6-7周龄雌性Balb/c小鼠，分别在免疫后的八个不同时间点获取小鼠脾脏细胞及骨髓细胞，用特异性抗体—CD19，CD27，CD38，IgD进行细胞表面抗体标记。通过流式细胞仪的筛选，分析记忆B细胞及浆细胞的含量变化。同时，建立四个实验组和一个空白组，分别为EV76（1/5）组、EV76（1/10×2）组、EV76（1/10）+F1亚单位疫苗组、F1亚单位疫苗+EV76（1/10）组及空白组，通过多次免疫后，采用酶联免疫法检测小鼠抗体滴度的变化。而后进一步通过流式细胞分离技术分离小鼠的B淋巴细胞，即幼稚B细胞，记忆B细胞及浆细胞三种细胞，采用Trizol法提取这三种细胞的总RNA。最终采用RNA-seq技术测定小鼠的幼稚B细胞、记忆B细胞和浆细胞的总RNA表达谱，进而进行表达谱的比较。通过本实验证明EV76减毒活疫苗及F1亚单位疫苗免疫小鼠后，无论在脾脏细胞及骨髓细胞均有记忆B细胞的产生，并存在先上升后下降的变化趋势，在免疫后7天，记忆B细胞及浆细胞开始产生，脾脏细胞及骨髓细胞中的记忆B细胞含量分别在免疫第42天和第56天时达到高峰，浆细胞含量在免疫第56天时达到高峰，而免疫第77时，记忆B细胞的总含量逐渐下降，直至免疫第98天记忆B细胞的含量已接近正常小鼠，浆细胞则在免疫第77天有所下降并维持一定水平。结果经过统计学分析，都具有显著性差异，具有统计学意义。酶联免疫法检测抗体滴度与记忆B细胞数量变化趋势大体一致，均在在第56天达到高峰，而后维持稳定的抗体滴度在一定水平上，且初次免疫EV76减毒活疫苗，而加强免疫F1亚单位疫苗的实验组其抗体滴度明显高于两次免疫EV76减毒活疫苗组的抗体滴度。总RNA测序将记忆B细胞与幼稚B细胞，浆细胞与幼稚B细胞，记忆B细胞与浆细胞进行比较。记忆B细胞与幼稚B细胞组共比对15765个基因，其中高表达基因697个，低表达基因820个，与细胞或免疫相关的基因共有131个；浆细胞与幼稚B细胞共比对16304个基因，其中高表达基因1574个，低表达基因451个，其中与细胞或免疫相关的基因有162个，记忆B细胞与浆细胞共比对16212个基因，其中高表达基因1495个，低表达基因252个，其中与细胞或免疫相关的基因有164个。依据研究结果表明，①在免疫早期记忆B细胞在脾脏细胞及骨髓细胞中均无产生，脾脏细胞中的记忆B细胞逐渐增多直至免疫第42天达到高峰，而骨髓中的记忆B细胞则在免疫第56天达到峰值，随后，脾脏细胞及骨髓细胞中的记忆B细胞的含量急剧下降，表明鼠疫疫苗免疫小鼠虽有产生但维持时间较短；另一方面，浆细胞在脾脏细胞中数量变化趋势虽与骨髓细胞中的数量变化趋势基本一致，但在总体数量上比较，浆细胞在脾脏细胞中的含量要远远高于骨髓细胞中的含量，这就说明浆细胞主要存在于脾脏细胞中。综上所述，我们推测小鼠在免疫后可以长期维持较高的抗体滴度是由于长寿命浆细胞的作用。②依据酶联免疫试验结果，我们可以得出，小鼠首次接受较少量抗原免疫后，当再次接触较大剂量的抗原免疫时，会产生明显升高的抗体滴度的变化。因此可得知，抗体滴度的变化不仅与记忆B细胞的产生有关，而且同时很有可能与小鼠体内的抗原—抗体数量比例也有着密切联系。③通过RNA-Seq技术对B淋巴细胞的三种亚群即幼稚B细胞、记忆B细胞和浆细胞的全基因组测序比对基因可以得出，与补体受体、免疫球蛋白家族、淋巴细胞抗原和细胞因子类等相关的基因在幼稚B细胞、记忆B细胞及浆细胞中均有发现，但这些基因在这三种细胞亚群中存在明显差异。

全文目录

缩略词表  6-7
摘要  7-10
Abstract  10-12
前言  12-19
  1. 鼠疫菌的概况与发展  12-13
  2. 淋巴细胞的分化与发育  13-14
  3. 鼠疫菌抑制宿主免疫系统  14
  4. 宿主对鼠疫菌的防御作用  14-15
  5. 宿主免疫反应的基本过程  15
  6. 鼠疫疫苗的研究  15-16
  7. 本实验的目的和意义  16-17
  8. 实验流程  17-19
1. 实验材料  19
  1.1 实验主要材料  19
  1.2 实验所用主要试剂  19
2. 实验方法  19-27
  2.1 动物实验  19-20
  2.2 脾脏细胞提取及标记  20-21
  2.3 骨髓细胞提取及标记  21-22
  2.4 细胞流式分析  22
  2.5 脾脏细胞分选  22-24
  2.6 RNA-Seq 技术的表达谱检测  24-25
  2.7 酶联检测法测定小鼠体内抗体  25-27
3.结果  27-60
  3.1 流式细胞分析  27-39
  3.2 流式细胞分选  39
  3.3 总 RNA 检测  39-40
  3.4 总 RNA 表达谱检测  40-59
  3.5 酶联免疫法检测免疫小鼠抗体的结果  59-60
4.讨论  60-63
综述  63-68
参考文献  68-72
附录  72-75
代表性论文  75-79
硕士期间完成的其他工作  79-80
硕士期间发表的论文  80-81
个人简历  81-82
致谢  82-83

鼠疫疫苗引起的小鼠记忆B细胞动态变化及其分子发育机制研究

内容摘要

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