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微小隐孢子虫CP15-P23-CP15/60三价亚单位疫苗和核酸疫苗的制备及其免疫保护性研究

作　者: 秦培兰
导　师: 陈兆国
学　校: 中国农业科学院
专　业: 预防兽医学
关键词: 微小隐孢子虫 CP15-P23-CP15/60 亚单位疫苗 核酸疫苗 免疫保护
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）是隶属于顶复合器门的专性肠道细胞内寄生原虫，对免疫功能正常的宿主可引起自限性腹泻，但是对免疫功能缺陷的宿主如艾滋病患者则具有潜在的生命威胁。目前，还没有有效的药物治疗隐孢子虫感染，因此，疫苗研制是防控本病感染的一个重要策略。本研究应用多个抗原表位预测软件对微小隐孢子虫CP15、P23和CP15/60三个子孢子表面抗原的多肽序列进行了T细胞表位预测及分析，从中选取了三个抗原表位富集的基因片段，利用重叠延伸PCR技术将该三个基因的全序列和三个筛选的表位富集片段序列分别进行串联，各基因片段之间以柔性氨基酸（GGGGS）的碱基序列连接，得到融合基因CP15-P23-CP15/60和CpTm，将其分别克隆到原核表达载体pET28（a+）上，构建重组表达质粒pET-CP15-23-60和pET-CpTm，并转化到大肠杆菌BL21（DE3）中进行诱导表达，将纯化的重组蛋白分别免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体。结果显示两个融合基因在大肠杆菌中高效表达，Western blot分析显示重组蛋白能被牛抗微小隐孢子虫阳性血清及隐孢子虫鼠基因型CP15、P23、CP15/60基因重组表达蛋白免疫兔血清识别，制备的抗血清能被重组蛋白特异性识别，表明表达的重组蛋白具有较好的反应原性和免疫原性。将重组表达蛋白rCP15-P23-CP15/60和rCpTm制备的亚单位疫苗分别免疫BALB/c小鼠，并与rCP15、rP23、rCP15/60制备的亚单位疫苗进行比较，对其诱导的特异性体液免疫和细胞免疫应答进行了检测，对小鼠隐孢子虫感染的免疫保护效果进行了观察。结果显示，试验组小鼠血清中特异性IgG抗体水平、CD4~+和CD8~+T淋巴细胞的数量、淋巴细胞增殖及细胞因子IFN-γ、IL-4分泌等免疫指标均呈现显著升高的趋势，表明重组蛋白能够诱导小鼠产生Th1/Th2混合型免疫反应。感染试验结果显示，试验组小鼠的排卵囊高峰延后3d；卵囊排出量明显减少，减卵率可达到37.43%~55.06%，其中rCP15-P23-CP15/60试验组效果最好，减卵率可达55.06%；rCP15-P23-CP15/60和rCpTm试验组排卵囊持续时间缩短。表明制备的两个三价亚单位疫苗能明显地诱导小鼠产生特异性免疫应答，对隐孢子虫感染具有较好的免疫保护作用，优于单价疫苗的保护作用。将融合基因CP15-P23-CP15/60和CpTm克隆到pVAX1质粒，成功构建了真核重组表达质粒pVAX-CP15-P23-CP15/60和pVAX-CpTm，将其免疫BALB/c小鼠，对其诱导的特异性体液免疫和细胞免疫应答进行了检测，对小鼠隐孢子虫感染的免疫保护效果进行了观察，并与pVAX-CP15、pVAX-P23、pVAX-CP15/60真核质粒的免疫效果进行比较。结果显示，试验组小鼠血清中特异性IgG抗体水平、CD4~+和CD8~+T淋巴细胞的数量、淋巴细胞增殖及细胞因子IFN-γ、IL-4分泌等免疫指标均呈现显著升高的趋势。感染试验结果显示，试验组小鼠的排卵囊高峰延后3d；卵囊排出量明显减少，减卵率可达35.6%~50.25%，其中pVAX-CP15-P23-CP15/60试验组效果最好，减卵率可达50.25%；pVAX-CP15-P23-CP15/60和pVAX-CpTm试验组排卵囊持续时间缩短。表明制备的两个三价核酸疫苗能明显地诱导小鼠产生特异性免疫应答，对隐孢子虫感染具有较好的免疫保护作用，优于单价疫苗的保护作用。本研究构建了隐孢子虫融合基因CP15-P23-CP15/60和CpTm，对其制备的亚单位疫苗和核酸疫苗的免疫保护效果进行了观察，对隐孢子虫病多价疫苗的研究进行了有益的探索，为研制高效预防疫苗提供基础。

全文目录


摘要  6-8
Abstract  8-14
英文缩略表  14-15
第一章 隐孢子虫病免疫机制研究进展  15-23
  1.1 先天性免疫  15-18
    1.1.1 肠黏膜上皮细胞  16
    1.1.2 先天性免疫中的 IFN-γ和自然杀伤细胞  16-17
    1.1.3 巨噬细胞和一氧化氮  17
    1.1.4 树突状细胞  17
    1.1.5 补体系统  17-18
  1.2 获得性免疫  18-21
    1.2.1 T 淋巴细胞  18
    1.2.2 辅助性 T 淋巴细胞在对抗 C.parvum 感染过程中占主要地位  18-19
    1.2.3 Th1 型细胞因子  19-20
    1.2.4 Th2 型细胞因子  20
    1.2.5 隐孢子虫感染的 B 细胞反应及抗体反应  20
    1.2.6 抗隐孢子虫抗体的被动免疫  20-21
  1.3 结论  21-23
第二章 微小隐孢子虫 CP15-P23-CP15/60 基因及其主要抗原表位区的串联表达  23-47
  2.1 实验材料  23-26
    2.1.1 载体、菌株和基因组 DNA  23
    2.1.2 实验动物  23
    2.1.3 主要试剂  23-24
    2.1.4 血清  24
    2.1.5 主要仪器  24
    2.1.6 主要试剂配制  24-26
  2.2 实验方法  26-38
    2.2.1 微小隐孢子虫 T 细胞抗原表位预测和筛选  26-27
    2.2.2 引物的设计与合成  27-28
    2.2.3 目的基因的 PCR 扩增及串联  28-31
    2.2.4 原核表达质粒的构建与鉴定  31-34
    2.2.5 重组质粒的诱导表达及纯化  34-37
    2.2.6 重组蛋白的 Western blot 分析  37-38
    2.2.7 重组蛋白的质谱色谱分析  38
    2.2.8 鼠抗血清的制备及鉴定  38
  2.3 实验结果  38-45
    2.3.1 微小隐孢子虫 T 细胞抗原表位预测和筛选  38
    2.3.2 目的基因的 PCR 扩增及串联  38-39
    2.3.3 原核表达质粒 pET-28a-CP15-23-60 和 pET-CpTm 的鉴定  39-40
    2.3.4 重组质粒 pET-28a-CP15-23-60 和 pET-CpTm 的诱导表达及纯化  40-43
    2.2.5 重组蛋白的 Western blot 分析  43-44
    2.2.6 重组蛋白的质谱色谱分析  44
    2.2.7 鼠抗血清的鉴定  44-45
  2.4 讨论  45-47
第三章 两个微小隐孢子虫三价亚单位疫苗的动物免疫保护研究  47-63
  3.1 实验材料  47-49
    3.1.1 菌株与重组蛋白  47
    3.1.2 实验动物与虫种  47
    3.1.3 主要试剂  47-48
    3.1.4 主要试剂的配制  48
    3.1.5 主要仪器  48-49
  3.2 实验方法  49-54
    3.2.1 重组蛋白制备  49-51
    3.2.2 动物分组和免疫  51
    3.2.3 体液免疫水平的检测  51
    3.2.4 细胞免疫水平的检测  51-53
    3.2.5 攻虫感染  53-54
  3.3 实验结果  54-61
    3.3.1 体液免疫水平变化  54-56
    3.3.2 CD4~+、CD8~+T 淋巴细胞数量变化  56-57
    3.3.3 免疫小鼠脾淋巴细胞增殖试验结果  57-58
    3.3.4 细胞因子检测结果分析  58-59
    3.3.5 动物保护性试验  59-61
  3.4 讨论  61-63
第四章 两个微小隐孢子虫三价核酸疫苗的动物免疫保护研究  63-77
  4.1 实验材料  63-64
    4.1.1 质粒与重组蛋白  63
    4.1.2 实验动物与虫种  63
    4.1.3 主要试剂  63
    4.1.4 主要试剂的配制  63-64
    4.1.5 主要仪器  64
  4.2 实验方法  64-67
    4.2.1 引物的设计与合成  64
    4.2.2 真核表达载体的构建及鉴定  64-65
    4.2.3 重组质粒的大量提取和纯化  65-66
    4.2.4 动物分组和免疫  66
    4.2.5 体液免疫水平的检测  66
    4.2.6 细胞免疫水平的检测  66-67
    4.2.7 攻虫感染  67
  4.3 实验结果  67-73
    4.3.1 真核表达载体的构建及鉴定  67-68
    4.3.2 体液免疫水平  68-69
    4.3.3 细胞免疫水平  69-72
    4.3.4 动物保护性试验  72-73
  4.4 讨论  73-77
第五章 全文结论  77-79
参考文献  79-87
致谢  87-89
作者简介  89

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学免疫学
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