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鼠疫耶尔森氏菌噬菌体Yep-phi基因组研究及其受体鉴定

作　者: 赵向娜
导　师: 杨瑞馥
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 军事预防医学
关键词: 鼠疫菌噬菌体尾丝蛋白受体外膜蛋白
分类号: R34
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

鼠疫的病原是鼠疫耶尔森氏菌（Yersinia pestis,简称鼠疫菌），属于肠杆菌科耶尔森氏菌属。鼠疫在历史上曾经引发三次世界范围的鼠疫大流行，给人类带来巨大的灾难。2000年，世界卫生组织已经将鼠疫列为重新抬头的传染病。鼠疫菌是传统的生物战剂，同时还是国际恐怖分子可能用于制造生物恐怖的首选微生物之一。鼠疫对于人类健康仍然是一个巨大的威胁，尤其是败血症鼠疫和肺鼠疫，若未及时治疗，通常是致命的。抗生素治疗（例如四环素和链霉素）被WHO专家委员会认为是治疗鼠疫的“金标准”，然而，耐药性鼠疫菌的出现给我们敲响了警钟，需要研制能够替代抗生素的方案。1995年在腺鼠疫患者体内分离到了第一株多重耐药鼠疫菌株,该菌株携带了能够抵抗12种抗生素（包括所有用于鼠疫预防和治疗的抗生素）的耐药基因。鼠疫菌噬菌体（bacteriophage）因对宿主的高度特异性和敏感性，对临床诊断和流行病学调查具有重要意义。随着多重耐药（multidrug resistant）鼠疫菌株的出现，噬菌体有可能成为预防和治疗鼠疫菌感染的抗生素替代品。Yep-phi是在中国分离的，常规用于鼠疫菌诊断的噬菌体，在不同温度下均能特异裂解鼠疫菌，在分类地位上属于T7噬菌体家族。Yep-phi的壳体由二十面体对称的头部和尾部组成，头部和尾部通过颈部相连。本研究对Yep-phi进行了全基因组序列的测定（序列登录号：HQ333270）和蛋白质组鉴定，Yep-phi基因组长度为38,611bp，含有217bp的末端重复，GC含量47.12mol%，与宿主鼠疫菌（47.6mol%）相似。共编码45个ORF。并与已测序的同属T7家族的鼠疫菌噬菌体PhiA1122（序列登录号：AY247822）、Berlin（序列登录号：AM183667）和Yepe2（序列登录号：EU734170）进行了比较基因组学分析。结果提示这4株烈性噬菌体可以明显分为两个亚群：Yep-phi亚群（Yep-phi、Berlin和Yepe2）和PhiA1122亚群（PhiA1122）。同源重组是近缘噬菌体的在进化过程中的重要机制，在Yep-phi亚群中预测到四个重组事件，说明这三株噬菌体在进化上是密切相关的。噬菌体裂解细菌的特异性主要取决于噬菌体与细菌细胞壁上特异性受体的相互识别与吸附。了解噬菌体受体结合蛋白与受体的结构功能有助于理解受体识别机制，进一步理解引发感染的后续步骤。目前已经鉴定出八株鼠疫菌噬菌体的受体（L-413C、P2vir1、PhiJA1、PhiA1122、Pokrovskaya、T7Yp、Y和PST），分别位于LPS的不同位置，这八株噬菌体包含了已经测序的PhiA1122和L-413C噬菌体。Yep-phi是T7类噬菌体，已鉴定的T7类噬菌体（例如T7、T3、PhiA1122、PhiYeO3-12）也都是以LPS为受体的。本研究以噬菌体Yep-phi为对象，鉴定了噬菌体受体结合蛋白与受体，通过噬菌体吸附实验、噬菌斑实验、亲和层析和Western Blotting实验，证实了除了鼠疫菌的LPS之外，外膜蛋白OmpF和Ail也是噬菌体受体，并评价了鼠疫菌受体突变株与回补株的裂解效率，鉴定了相互作用的结构域和介导相互作用的关键氨基酸。尾丝蛋白gp17第510-529位氨基酸是介导相互作用的结构域，尾丝蛋白518N、519N、523S是识别OmpF的关键位点，而518N、519N、522C和523S是识别Ail的关键位点。本研究首次鉴定了外膜蛋白可作为T7类噬菌体的受体。而Yep-phi受体与其它T7类噬菌体的差别是由尾丝蛋白的序列特异性所决定的，这项工作证实了尾丝蛋白在进化中和多样的噬菌体系统中的重要性，同时对于发展噬菌体治疗鼠疫菌感染和鉴定鼠疫菌的技术以及理解噬菌体与细菌的相互作用具有重要意义。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-10
缩略语  10-12
前言  12-24
  1. 噬菌体  12-15
  2. 鼠疫耶尔森氏菌  15-16
  3. 鼠疫菌噬菌体  16-21
  4. 鼠疫菌噬菌体受体研究  21-22
  5. 本研究的目的与主要内容  22-24
第一章鼠疫菌噬菌体 Yep-phi 全基因组测序  24-52
  1. 前言  24-25
  2. 材料与方法  25-34
    2.1 菌株  25
    2.2 酶和试剂盒  25
    2.3 噬菌体的铺平板培养  25-26
    2.4 通过平板裂解和洗脱制备噬菌体原种  26-27
    2.5 噬菌体大规模培养（高复数感染法）  27
    2.6 噬菌体纯化  27-28
    2.7 电镜观察噬菌体形态  28
    2.8 噬菌体 DNA 提取  28-29
    2.9 噬菌体 DNA 鸟枪法测序  29-30
    2.10 噬菌体基因组一般特性分析  30
    2.11 基因预测及功能注释  30
    2.12 噬菌体 DNA 结构鉴定  30-31
    2.13 噬菌体 DNA 末端重复序列鉴定  31-32
    2.14 噬菌体对假结核菌的裂解情况  32-33
    2.15 蛋白质组学分析  33
    2.16 比较基因组学分析  33-34
  3. 结果与讨论  34-51
    3.1 噬菌斑形态  34
    3.2 噬菌体形态  34-35
    3.3 噬菌体 DNA 提取  35
    3.4 噬菌体基因组特征  35-36
    3.5 基因预测及功能注释  36-44
    3.6 基因组结构鉴定  44
    3.7 末端鉴定  44
    3.8 对假结核菌的裂解  44-47
    3.9 蛋白质组学  47-48
    3.10 比较基因组学分析  48-50
    3.11 对 Yep-phi 亚群的重组分析  50-51
  4.小结  51-52
第二章鼠疫菌噬菌体 Yep-phi 受体鉴定  52-94
  1. 前言  52-54
  2. 材料与方法  54-72
    2.1 菌株与质粒  54
    2.2 主要试剂  54
    2.3 主要仪器  54
    2.4. 蛋白表达与纯化  54-57
    2.5 多克隆抗体制备  57-58
    2.6 尾丝蛋白与噬菌体竞争吸附鼠疫菌实验  58
    2.7 尾丝蛋白抗体阻断噬菌体吸附实验  58-59
    2.8 受体性质鉴定  59
    2.9 蛋白类受体鉴定  59-60
    2.10 突变株的构建  60-64
    2.11 回补株的构建  64-66
    2.12 突变株与回补株的吸附效率评价  66-67
    2.13 突变株与回补株的裂解效率评价  67
    2.14 蛋白质相互作用的 Western Blotting 验证  67-68
    2.15 尾丝蛋白截短体构建、表达与纯化  68-72
  3. 结果与讨论  72-92
    3.1 尾丝蛋白氨基酸序列比对  72-74
    3.2 尾丝蛋白表达与纯化  74-75
    3.3 尾丝蛋白与噬菌体竞争吸附鼠疫菌  75-76
    3.4 尾丝蛋白抗体阻断噬菌体  76
    3.5 噬菌体受体性质  76-77
    3.6 蛋白类受体鉴定  77-80
    3.7 外膜蛋白表达与纯化  80
    3.8 突变株与回补株的构建  80-83
    3.9 噬菌体吸附效率评价和裂解效率评价  83-85
    3.10 相互作用验证与关键氨基酸位点鉴定  85-92
  4. 小结  92-94
参考文献  94-100
综述  100-104
  参考文献  103-104
代表性论文  104-110
附录  110-115
  主要仪器  110-112
  常用试剂  112-115
攻读博士学位期间发表的综述和研究论文  115-117
个人简历  117-118
致谢  118-119

鼠疫耶尔森氏菌噬菌体Yep-phi基因组研究及其受体鉴定

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