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新型荧光衍生法测定细胞凋亡关键酶活性

作　者: 刘家池
导　师: 梁建英
学　校: 复旦大学
专　业: 药物分析学
关键词: 荧光衍生 亮氨酸脑啡肽 细胞凋亡 Caspase-3 Caspase-8
分类号: R329
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象,在多细胞生物去除不需要的或异常的细胞中起着必要的作用。它在生物体的进化、内环境的稳定以及多个系统的发育中起着重要的作用。尽管凋亡过程的详细机制尚不完全清楚,但是已经确定Caspase即半胱天冬蛋白酶在凋亡过程中是起着必不可少的作用,细胞凋亡的过程实际上是Caspase不可逆有限水解底物的级联放大反应过程,到目前为止,至少已有14种Caspase被发现,Caspase分子间的同源性很高,结构相似,都是半胱氨酸家族蛋白酶。Caspase酶是细胞凋亡关键酶,因此其活性检测就成为判断细胞凋亡程度的重要标准。最近,我们课题组发现多肽能够与儿茶酚和高碘酸钠在pH7.5进行缩合反应,形成单一的荧光产物,激发最大波长在390nm附近,发射波长在490nm左右。更为重要的是,自由氨基酸、葡萄糖和半乳糖等糖类化合物、精胺等多胺化合物以及DNA碱基如腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶等相同反应条件下均不产生荧光。因此,新型荧光衍生方法检测caspase酶的活性专属性强,操作简便,利于推广,具有一定的应用前景。课题第一部分首先对寡肽荧光衍生条件进行了优化,在此基础上再对高效液相分析条件进行了优化。优化后的荧光衍生体系为：供试液100μL,儿茶酚(10mmol/L) 100μL,高碘酸钠(12 mmol/L)50μL,硼酸(300 mmol/L,pH 7.0)50μL,加热温度120℃,加热时间10 min。优化后的色谱条件为：色谱柱：CAPCELL PAK C18 MGS5 (5 u m,150 mm X 4.6 mm I.D.);流动相：A(250 mmol/L硼酸,氢氧化钠调pH值到7.5,20%)：B(水,80-0%)：C(甲醇,0-80%)(v/v/v),梯度时间40 min；流速为1.0 mL/min;柱温：30℃；荧光检测波长：激发波长390 nm,发射波长490 nm；进样量：20μL课题第二部分用新型荧光衍生方法测定亮氨酸脑啡肽并与紫外检测方法、OPA衍生法进行了比较。亮氨酸脑啡肽是一种非常重要的内源肽,其氨基酸顺序和结构为：酪氨酸-甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu)。体外试验中,保留时间为25min,线性范围为0.5～50.0 mg/L(r=0.9999),最低定量限为0.25 mg/L；模拟血浆实验中,内源物质不干扰测定,线性范围为0.5～50.0mg/L(r=0.9998),最低定量限为0.5 mg/L。血浆中内源性干扰物质多,紫外检测方法和OPA衍生法都不能有效检测亮氨酸脑啡肽的含量。课题第三部分是本课题重点,利用新型荧光衍生方法来检测两种细胞系人宫颈癌细胞(Hela细胞)和人肺腺癌细胞(A549细胞)受诱导凋亡后的caspase-3和caspase-8的活性。每种细胞系均采用三种诱导凋亡方法：低温辅助紫外照射诱导凋亡,丝裂霉素C诱导凋亡和喜树碱诱导凋亡。Caspase酶底物设计为在特异识别序列N端加上具有亲水性氨基酸丝氨酸,这可以增加底物水溶性,N端延长序列同时能增加底物专属性,C端加上实验证明衍生效率较高的两种寡肽片段LG和ALG。本部分采用市场上常用的caspase-3,8活性检测试剂盒作为新型荧光衍生方法的对照,结果表明,两种方法的活性检测相似(r=0.9556,P<0.01),表明新方法具有可靠性,同时,重组caspase酶实验表明新方法具有更好的专属性,因此新型荧光衍生方法可以作为检测caspase酶活性的可靠方法。

全文目录


摘要  10-12
ABSTRACT  12-14
前言  14-16
第一部分 寡肽荧光衍生条件和高效液相分析条件考察  16-27
  (一) 寡肽荧光衍生条件的优化  16-21
    1.实验方法  16-17
      1.1 仪器与试药  16-17
        1.1.1 仪器  16-17
        1.1.2 试药  17
        1.1.3 溶液的配制  17
      1.2 荧光衍生方法  17
      1.3 HPLC色谱条件  17
    2.实验结果  17-21
      2.1 加热时间考察  17-18
      2.2 加热温度考察  18-19
      2.3 反应介质浓度考察  19
      2.4 反应介质pH值考察  19-20
      2.5 儿茶酚浓度考察  20-21
      2.6 高碘酸钠浓度考察  21
  (二) 高效液相色谱条件的优化  21-26
    1.实验方法  21-22
      1.1 仪器与试药  21-22
        1.1.1 仪器  21
        1.1.2 试药  21-22
        1.1.3 溶液的配制  22
      1.2 荧光衍生方法  22
      1.3 HPLC色谱条件  22
    2.实验结果  22-26
      2.1 磷酸盐考察  22
      2.2 缓冲液浓度考察  22-23
      2.3 缓冲液pH值考察  23-24
      2.4 流动相比例优化  24
      2.5 检测波长考察  24
      2.6 考察优化色谱条件下混合体系分离情况  24-26
  (三) 小结  26-27
第二部分 新型荧光衍生方法测定亮氨酸脑啡肽并与紫外检测方法、OPA衍生法比较  27-44
  (一) 新型荧光衍生方法测定亮氨酸脑啡肽的含量  28-35
    1 实验方法  28-29
      1.1 仪器与试药  28
        1.1.1 仪器  28
        1.1.2 试药  28
      1.2 溶液的配制  28
      1.3 血样处理及测定  28-29
      1.4 荧光衍生方法  29
      1.5 HPLC色谱条件  29
    2 实验结果  29-35
      2.1 体外系统中亮氨酸脑啡肽含量测定  29-32
        2.1.1 系统适应性实验  29-30
        2.1.2 标准曲线和线性范围  30
        2.1.3 精密度实验  30-31
        2.1.4 方法回收率实验  31
        2.1.5 检出限和定量限  31-32
      2.2 模拟血浆中亮氨酸脑啡肽含量测定  32-35
        2.2.1 系统适应性试验  32
        2.2.2 标准曲线和线性范围  32-33
        2.2.3 精密度实验  33
        2.2.4 准确度  33-34
        2.2.5 检出限和定量限  34
        2.2.6 稳定性实验  34-35
  (二) 紫外方法测定亮氨酸脑啡肽的含量  35-39
    1 实验方法  35-36
      1.1 仪器与试药  35
        1.1.1 仪器  35
        1.1.2 试药  35
      1.2 溶液的配制  35-36
      1.3 色谱条件  36
    2 实验结果  36-39
      2.1 系统适应性实验  36
      2.2 标准曲线和线性范围  36-37
      2.3 精密度实验  37
      2.4 回收率实验  37-38
      2.5 检出限和定量限  38
      2.6 稳定性实验  38
      2.7 模拟血浆实验  38-39
  (三) OPA衍生法测定亮氨酸脑啡肽的含量  39-43
    1 实验方法  39-40
      1.1 仪器与试药  39
        1.1.1 仪器  39
        1.1.2 试药  39
      1.2 溶液的配制  39-40
      1.3 柱前衍生化反应  40
      1.4 色谱条件  40
    2 实验结果  40-43
      2.1 系统适应性实验  40-41
      2.2 标准曲线和线性范围  41
      2.3 精密度实验  41-42
      2.4 回收率实验  42
      2.5 检出限和定量限  42
      2.6 稳定性实验  42
      2.7 OPA衍生化法模拟血浆实验考察  42-43
  (四) 讨论  43-44
第三部分 新型荧光衍生法-HPLC测定细胞凋亡关键酶caspase-3和caspase-8的活性  44-97
  (一) Caspase酶活性检测模型的建立和方法学考察  48-60
    1 实验方法  48-52
      1.1 仪器与试药  48-49
        1.1.1 仪器  48
        1.1.2 试药  48-49
      1.2 细胞  49
      1.3 溶液的配制  49
      1.4 考马斯亮蓝测定蛋白含量方法  49-50
      1.5 荧光衍生方法  50
      1.6 HPLC色谱条件  50
      1.7 Caspase酶活性测定细胞模型的建立  50-51
      1.8 Caspase酶活性测定操作流程  51-52
    2 实验结果  52-60
      2.1 考马斯亮蓝测定蛋白含量  52-53
      2.2 寡肽片段LG-2的方法学考察  53-56
        2.2.1 系统适应性实验  53
        2.2.2 标准曲线和线性范围  53-54
        2.2.3 精密度实验  54
        2.2.4 回收率实验  54-55
        2.2.5 提取回收率实验  55
        2.2.6 检出限和定量限  55
        2.2.7 稳定性  55-56
      2.3 寡肽片段AG-3的方法学考察  56-60
        2.3.1 系统适应性实验  56-57
        2.3.2 标准曲线和线性范围  57-58
        2.3.3 精密度实验  58
        2.3.4 回收率实验  58
        2.3.5 提取回收率实验  58-59
        2.3.6 检出限和定量限  59
        2.3.7 稳定性  59-60
  (二) 新型荧光衍生法测定Caspase酶活性  60-81
    1 Caspase-3酶活性测定  60-69
      1.1 Hela细胞Caspase-3酶活性测定  60-64
        1.1.1 Hela细胞对照组测定  60
        1.1.2 低温辅助紫外照射诱导Hela细胞凋亡模型Caspase-3酶活性测定  60-62
        1.1.3 丝裂霉素C(MMC)诱导Hela细胞凋亡模型Caspase-3酶活性测定  62-63
        1.1.4 喜树碱诱导Hela细胞凋亡模型Caspase-3酶活性测定  63-64
      1.2 A549细胞Caspase-3酶活性测定  64-69
        1.2.1 A549细胞对照组Caspase-3酶活性测定  64-65
        1.2.2 低温辅助紫外照射诱导A549细胞凋亡模型Caspase-3酶活性测定  65-67
        1.2.3 丝裂霉素C(MMC)诱导A549细胞凋亡模型Caspase-3酶活性测定  67-68
        1.2.4 喜树碱诱导A549细胞凋亡模型Caspase-3酶活性测定  68-69
    2 Caspase-8酶活性测定  69-78
      2.1 Hela细胞Caspase-8酶活性测定  69-73
        2.1.1 Hela细胞对照组测定  69
        2.1.2 低温辅助紫外照射诱导Hela细胞凋亡模型Caspase-8酶活性测定  69-71
        2.1.3 丝裂霉素C(MMC)诱导Hela细胞凋亡模型Caspase-8酶活性测定  71-72
        2.1.4 喜树碱诱导Hela细胞凋亡模型Caspase-8酶活性测定  72-73
      2.2 A549细胞Caspase-8酶活性测定  73-78
        2.2.1 A549细胞对照组Caspase-8酶活性测定  73-74
        2.2.2 低温辅助紫外照射诱导A549细胞凋亡模型Caspase-8酶活性测定  74-75
        2.2.3 丝裂霉素C(MMC)诱导A549细胞凋亡模型Caspase-8酶活性测定  75-76
        2.2.4 喜树碱诱导A549细胞凋亡模型Caspase-8酶活性测定  76-78
    3 小结  78-81
  (三) 商用试剂盒测定Caspase酶活性  81-92
    1 pNA标准曲线的测定  81
    2 Caspase-3酶活性测定  81-85
      2.1 Hela细胞Caspase-3酶活性测定  81-83
      2.2 A549细胞Caspase-3酶活性测定  83-85
    3 Caspase-8酶活性测定  85-90
      3.1 Hela细胞Caspase-8酶活性测定  85-87
      3.2 A549细胞Caspase-8酶活性测定  87-90
    4 小结  90-92
  (四) 新型荧光衍生法和商用试剂盒比较  92-95
    1 相对活性比较  92-93
    2 专属性比较  93-95
  (五) 本章小结和讨论  95-97
参考文献  97-100
全文总结  100
本文创新  100-101
附录Ⅰ 细胞凋亡关键酶Caspase活性检测方法(综述)  101-113
附录Ⅱ 发表论文  113-114
致谢  114-115

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体形态学 > 人体组织学
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