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乌贼墨肽聚糖抗前列腺癌活性研究及产品研发

作　者: 郑玉寅
导　师: 丁国芳
学　校: 浙江海洋学院
专　业: 海洋生物学
关键词: 乌贼墨肽聚糖分离纯化前列腺癌抗肿瘤活性胶囊剂
分类号: R285.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

前列腺癌(PCa)是发生于男性前列腺组织中的恶性肿瘤,前列腺癌的发病率具有明显的地理和种族差异,在西方国家是一个高发病率的疾病。近年来,在我国男性疾病中的比例也逐渐上升,而传统的治疗手段都有一定的副作用,因此,找到一种特异性强且副作用小的抗肿瘤药物非常迫切。乌贼墨,在上世纪就有日本学者发现其具有抗肿瘤活性,但是乌贼墨中特定成分的抗肿瘤活性研究的比较少,而此类的功能食品或者是药物几乎没有。本实验以传统的水提醇沉法从乌贼墨中提取肽聚糖,粗提物通过分离纯化,纯度检测,结构表征,氨基酸成分检测等步骤得到肽聚糖纯化物,并进行抗肿瘤活性检测；然后从体内和体外两方面探讨乌贼墨肽聚糖的抑瘤活性和初步的抗肿瘤机制；最后经过毒理实验,检测其毒性,然后试研制出相关的产品。具体有如下几个部分。第一部分,乌贼墨肽聚糖制备。首先将匀浆后的乌贼墨加入丙酮置于-20℃中脱脂12h,离心,干燥,用0.1MTris-Hcl缓冲液(PH6.8)在4℃下浸泡24h,离心取上清,重复2次。加入3倍体积乙醇沉淀,收集沉淀加入sevag试剂4℃过夜分层,去除游离的蛋白等杂质,冷冻干燥备用。粗提物过DEAE-52阴离子交换层析柱后,得到4个组分,同时采用苯酚-硫酸法检测糖峰,最终收集最佳峰的洗脱液,冷冻干燥。将干燥物经过Sephadex G-75葡聚糖凝胶后,得到一个组分,收集该峰,冷冻干燥。将该组分经过高效液相色谱和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测纯度,得到单一组分,最后将该样品通过紫外和红外扫描进行结构表征。第二部分,主要从体外探讨乌贼墨肽聚糖对前列腺癌细胞(DU-145、PC-3)的作用机制。1、采用MTT法测定肽聚糖的浓度、作用时间对细胞增殖抑制效果的关系。结果发现,乌贼墨肽聚糖对PC-3细胞的抑制活性与作用时间和样品浓度呈现正相关。2、HE染色观察乌贼墨肽聚糖作用后两种细胞的生长情况和形态变化情况。结果发现,肽聚糖作用后的细胞出现形态不规则,细胞数目减少,细胞质出现空泡,细胞轮廓模糊,核仁数目减少,染色质凝固的形态学改变。3、采用AO/EB法观察两种细胞的调亡情况。结果显示,对照组无明显的凋亡细胞,5mg/mL组出现早期凋亡细胞,10mg/mL、15mg/mL乌贼墨肽聚糖作用组出现晚期凋亡细胞和死亡细胞,且数目逐渐增多,细胞被染成桔红色,并且出现明显的凋亡小体。4、Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞术分析乌贼墨肽聚糖作用后两种细胞的早期凋亡情况。结果显示,浓度分别为5mg/mL、10mg/mL和15mg/mL的乌贼墨肽聚糖作用24h后,DU-145和PC-3细胞都出现凋亡,且早期凋亡细胞随着作用药物浓度的增加而增加。5、免疫组化法(SABC)检测肽聚糖作用前后细胞中COX-2和VEGF蛋白的表达情况。结果表明,乌贼墨肽聚糖对DU.145和PC-3细胞作用24h后,COX-2和VEGF蛋白表达急剧下降,阳性表达减弱,表明肽聚糖能抑制新生血管的生成。6、原位杂交方法检测乌贼墨肽聚糖作用前后细胞中Bcl-2mRNA和Caspase-3mRNA表达的情况。结果表明,PC-3和DU-145细胞在15mg/mL肽聚糖作用24h后,与对照组相比,细胞中Bcl-2mRNA表达量下降；两种细胞中Caspase-3mRNA表达量增加。表明乌贼墨肽聚糖诱导DU-145和PC-3细胞凋亡的机理可能是通过下调Bcl-2mRNA表达,上调Caspase-3mRNA表达。第三部分,肽聚糖对人(PC-3细胞)移植裸鼠模型肿瘤生长抑制研究。建立小鼠PC.3细胞移植瘤模型,分别腹腔注射高(1g/kg)、中(0.5g/kg)、低(0.25g/kg)浓度乌贼墨肽聚糖,环磷酰胺(0.02g/kg)阳性对照,生理盐水空白对照；小鼠给药30天后,称重,处死,检测各组的瘤重,肝重。结果表明,乌贼墨PGN低、中和高剂量组对PC-3移植瘤均有抑制作用,抑瘤率分别为7.81%、23.43%和35.36%,与剂量呈现正相关。第四部分,乌贼墨肽聚糖的毒性研究和产品的制备。1、将试验昆明小鼠分组进行最大给药量试验,结果发现,乌贼墨肽聚糖实验组小鼠最大给药量为21.00g/kg.d,且试验过程中没有小鼠死亡。2、采用乙醇制粒的方法将样品与淀粉的混合物制成粘性适中的软材料,再制成颗粒,用干燥箱烘干,整粒后填充,包装。实验中的筛网目数分别是20和80目,乌贼墨与淀粉的比例为1：9,干燥温度为60℃,每粒胶囊内容物含量为0.4±0.05g。

全文目录

摘要  10-12
ABSTRACT  12-14
第一章前言  14-19
  1.1 前列腺癌现状  14
  1.2 乌贼墨及提取物研究现状  14-16
  1.3 COX-2、VEGF、Bcl-2和Caspase-3的特征与肿瘤的关系  16-17
    1.3.1 COX-2的特征与肿瘤的关系  16
    1.3.2 VEGF的特征和肿瘤的关系  16-17
    1.3.3 Bcl-2的特征与肿瘤的关系  17
    1.3.4 Caspase-3的特征与肿瘤的关系  17
  1.4 海洋保健食品的现状  17-18
  1.5 研究目的和意义  18-19
    1.5.1 研究目的  18
    1.5.2 研究意义  18-19
第二章海洋保健食品研发进展综述  19-26
  2.1 海洋生物活性物质  19-20
  2.2 海洋保健食品研发现状  20-23
    2.2.1 鱼油系列  20
    2.2.2 海洋藻类系列  20-21
    2.2.3 水解蛋白系列  21
    2.2.4 贝类系列  21-22
    2.2.5 甲壳素系列  22
    2.2.6 软骨系列  22-23
    2.2.7 其它  23
  2.3 海洋保健食品展望  23
  参考文献  23-26
第三章乌贼墨肽聚糖的制备工艺  26-36
  3.1 材料与方法  26-29
    3.1.1 材料  26-27
    3.1.2 方法  27-29
  3.2 结果  29-34
    3.2.1 分离纯化  29-30
    3.2.2 高效液相纯度测定结果  30-31
    3.2.3 SDS-PAGE电泳数据结果  31
    3.2.4 紫外全波长扫描  31-32
    3.2.5 红外光谱扫描肽聚糖图谱  32-33
    3.2.6 氨基酸组分及含量  33-34
    3.2.7 纯化物对DU-145和PC-3细胞增殖抑制作用  34
  3.3 讨论  34-36
第四章乌贼墨肽聚糖对前列腺癌PC-3、DU145细胞作用机制研究  36-57
  4.1 材料与方法  36-39
    4.1.1 材料  36
    4.1.2 方法  36-39
  4.2 结果  39-54
    4.2.1 细胞形态学观察  39-41
    4.2.2 AO/EB染色荧光显微镜观察  41-43
    4.2.3 流式细胞术检测结果  43-45
    4.2.4 免疫组化结果  45-50
    4.2.5 乌贼墨肽聚糖对DU-145和PC-3细胞中Bcl-2mRNA和Caspase-3mRNA阳性表达的影响  50-54
  4.3 讨论  54-57
第五章肽聚糖对人移植裸鼠模型肿瘤生长抑制作用的研究  57-61
  5.1 材料和方法  57-58
    5.1.1 材料  57
    5.1.2 仪器  57
    5.1.3 方法  57-58
    5.1.4 统计学处理  58
  5.2 结果  58-59
    5.2.1 乌贼墨PGN对PC-3移植瘤裸鼠体重、肝重的影响  58-59
    5.2.2 乌贼墨PGN对PC-3移植瘤裸鼠的抑制作  59
  5.3 讨论  59-61
第六章乌贼墨肽聚糖急性毒理实验和胶囊剂的制作  61-65
  6.1 材料和方法  61-62
    6.1.1 材料  61
    6.1.2 试验方法  61-62
    6.1.3 统计学处理  62
  6.2 结果  62-63
    6.2.1 急性毒理试验结果  62-63
    6.2.2 胶囊剂成型  63
  6.3 讨论  63-65
第七章结语和展望  65-67
  7.1 结语  65
  7.2 展望  65-67
缩略词表  67-68
参考文献  68-72
致谢  72-73
在读期间发表的学术论文及研究成果  73

乌贼墨肽聚糖抗前列腺癌活性研究及产品研发

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