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江苏地区大宗淡水鱼养殖池塘气单胞菌分离、鉴定和遗传多样性研究

作　者: 王一娟
导　师: 戈贤平
学　校: 南京农业大学
专　业: 水产养殖
关键词: 气单胞菌 16S rRNA基因 管家基因 系统发育 毒力基因
分类号: S941
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


本研究通过RS选择性培养基,从采集自江苏大宗淡水鱼养殖池塘的未发病池塘和发病池塘的样品中共分离到182株细菌。氧化酶、触酶和O/F实验分析显示,其中152株为疑似气单胞菌。运用16S rRNA通用引物测得实验菌株的16S rRNA的部分序列,在GenBank数据库中用NCBI-BLAST软件进行同源性检索,结果显示152株实验菌株中有89株为气单胞菌属,其中有63株可鉴定到种的水平(63/89,70.8%)。再运用相同方法根据气单胞菌的gyrB基因对剩下的26株用16S rRNA序列无法鉴定至种的菌株进行鉴定。结果发现,不管是在正常养殖塘口中还是在发病池塘中,以维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)分布最广泛、数量最多(未发病池塘菌株：31/37,83.8%；发病池塘菌株：39/52,75%),而嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)分布不广泛、数量也较少(未发病池塘菌株：1/37,2.7%；发病池塘菌株：10/52,19.2%)。除此之外,还分离出少量的杀鲑气单胞(Aeromonas salmonicida)中间气单胞菌(Aeromonas media)和简达气单胞菌(Aeromonas jandaet)。利用PCR法检测89株气单胞菌气溶素(aer)、溶血素(hly)和细胞兴奋性肠毒素(alt)三种毒力基因,结果发现,89株气单胞菌中含有气溶素基因的有20株,占气单胞菌总数的22.5%；含有溶血素基因的有34株,占气单胞菌总数的38.2%；含有细胞兴奋性肠毒素基因的有34株,占气单胞菌总数的38.2%。其中37株环境菌株中有9株未扩出这3种毒力基因的目的条带,其余28株致病性气单胞菌均扩增出数量不等的毒力基因条带。28株环境菌株的毒力基因型主要以2种及以上的基因型组合为主。52株病原菌株中有19株未扩增出这3株毒力基因的目的条带,其余33株致病性气单胞菌均扩增出数量不等的毒力基因条带。33株病原菌株的毒力基因型组合无明显规律。由于A. veronii在大宗淡水鱼养殖池塘中分布广泛,因此利用A. veronii的16S rRNA序列和管家基因序列对其进行遗传多样性分析。从基于16S rRNA基因序列的NJ系统发育树上可知,常州地区未发病池塘和发病池塘分离得到的A. veronii可分为两大遗传类群,在第一类群中,共有30株A. veronii,第二类群中共有14株A. veronii,未发病池塘和发病池塘的A. veronii交错分布在系统发育树上。常州、无锡和盐城三个地区不同发病池塘分离得到的A. veronii主要分为三大遗传类群,第一类群中共有20株A. veronii,其中常州地区分离得到的有11株,无锡地区的有8株,盐城地区的有1株；在第二类群中共有11株A. veronii,其中常州地区分离得到的有6株,无锡地区的有4株,盐城地区的有1株；在第三类群中共有7株A. veronii,其中常州地区分离得到的有4株,无锡地区的有2株,盐城地区的有1株,三大遗传类群中A. veronii多是相同地区的聚在一起。从基于联合16S rRNA、gyrB和dnaJ基因序列的NJ系统发育树上可知,常州地区未发病池塘和发病池塘分离得到的A. veronii可分为四大遗传类群,第一类群中共有18株A. veronii,其中未发病池塘中分离的有10株,发病池塘中分离的有8株；第二类群中共有15株A. veronii,其中未发病池塘中分离的有11株,发病池塘中分离的有4株；在第三类群中共有6株A. veronii,2株为未发病池塘水体分离,1株为健康团头鲂肠道内容物分离的,3株为发病池塘鱼体分离的；第四类群中,健康团头鲂肠道IA0804与病样FA0903,健康团头鲂肠道IA0815与水样WA0916分别聚类。不同地区发病池塘分离得到的A. veronii分为两大遗传类群,第一类群中共有22株A. veronii,其中常州地区分离得到的有12株,无锡地区的有10株；在第二类群共有16株A. veronii,其中常州地区分离得到的有9株,无锡地区的有4株,而盐城地区发病池塘分离的有3株,不同地区发病池塘分离得到的A. veronii大多数能够按照地域聚在一起。

全文目录


目录  4-8
摘要  8-10
ABSTRACT  10-12
第一章 文献综述  12-32
  1 气单胞菌概述  12-15
    1.1 气单胞菌的分类地位  12-13
    1.2 气单胞菌的生化特性  13-15
      1.2.1 气单胞菌的选择性分离  13-14
      1.2.2 气单胞菌的生化特性  14-15
  2 16S rRNA基因序列鉴定和分析  15-21
    2.1 16S rRNA基因及其特点  16-17
    2.2 16S rRNA基因序列分析技术  17
    2.3 16S rRNA基因序列在细菌分类鉴定中的应用  17-20
    2.4 利用16S rRNA序列进行系统发育分析  20-21
  3 管家基因序列鉴定和分析  21-24
    3.1 促旋酶(gyrase)B亚单位基因gyrB  21-23
      3.1.1 gyrB基因简介  21-22
      3.1.2 gyrB基因在细菌鉴定及系统发育分析中的应用  22-23
    3.2 热应激蛋白基因dnaJ  23-24
      3.2.1 dnaJ基因简介  23
      3.2.2 dnaJ家族分子结构  23
      3.2.3 dnaJ序列的应用  23-24
  4 系统发育树的构建方法  24-27
    4.1 构建系统发育树的方法——邻接法(Neighbor Joining,NJ)  24-25
    4.2 系统发育树的可靠性检验  25-26
    4.3 系统发育分析的常用软件  26-27
      4.3.1 MEGA(Molecular Evolutionary Genetics Analysis)  26
      4.3.2 PAUP(Phylogenetic Analysis Using Parsimony)  26
      4.3.3 PHYLIP(PHYLogeny Inference Package)  26-27
      4.3.4 MrBayes  27
  5 气单胞菌的致病作用  27-28
  6 气单胞菌毒力基因  28-29
    6.1 气溶素基因(Aerolysin gene)  28
    6.2 溶血素(Hemolysin)  28-29
    6.3 细胞兴奋性肠毒素(Cytotonic enterotoxin)  29
  7 本研究的目的、意义以及研究内容  29-32
第二章 气单胞菌的分离、保存、生化特性和分子鉴定  32-54
  1 材料  32-36
    1.1 菌株来源  32-33
    1.2 培养基和试剂  33-35
    1.3 仪器和设备  35-36
  2 方法  36-44
    2.1 样品细菌的分离、保存和活化  36
      2.1.1 环境株的分离和保存  36
      2.1.2 病原菌的分离和保存  36
      2.1.3 细菌的活化  36
    2.2 生化鉴定  36-37
      2.2.1 氧化酶实验  36-37
      2.2.2 触酶试验  37
      2.2.3 O/F实验  37
    2.3 细菌的保存  37
    2.4 细菌DNA模板的制备  37-39
      2.4.1 实验前准备  37
      2.4.2 细菌DNA的提取  37-39
    2.5 细菌16s rRNA基因序列扩增  39-43
      2.5.1 引物  39
      2.5.2 目的片段的PCR扩增  39
      2.5.3 琼脂糖凝胶中的DNA回收  39-40
      2.5.4 目的片段与载体的连接  40
      2.5.5 DH5a感受态细胞的制备  40-41
      2.5.6 DNA的转化  41-42
      2.5.7 重组质粒的筛选  42
      2.5.8 碱裂解法抽提质粒  42
      2.5.9 重组质粒的双酶切鉴定  42-43
    2.6 细菌gyrB管家基因测序  43
      2.6.1 引物  43
      2.6.2 目的片段PCR扩增  43
      2.6.3 PCR产物测序  43
    2.7 生化特性实验  43-44
    2.8 数据处理  44
  3 结果与分析  44-46
    3.1 细菌的分离  44
    3.2 气单胞菌分子鉴定结果  44-46
      3.2.1 未发病池塘气单胞菌鉴定结果  45-46
      3.2.2 发病池塘气单胞菌鉴定结果  46
    3.3 气单胞菌的生化特性  46
  4 讨论  46-54
    4.1 分析比较16S rRNA基因和管家基因扩增序列鉴定气单胞菌  46-47
    4.2 气单胞菌鉴定结果分析  47-54
      4.2.1 未发病池塘气单胞菌鉴定结果分析  48
      4.2.2 发病池塘气单胞菌鉴定结果分析  48-54
第三章 气单胞菌毒力基因的检测  54-66
  1 材料  54
    1.1 实验菌株  54
    1.2 试剂  54
    1.3 仪器和设备  54
  2 方法  54-57
    2.1 细菌DNA模板的制备  54
    2.2 气溶素(aer)基因的检测  54-55
      2.2.1 引物  54-55
      2.2.2 目的片段PCR扩增  55
      2.2.3 PCR扩增产物的检测  55
    2.3 溶血素(hly)基因的检测  55-56
      2.3.1 引物  55
      2.3.2 目的片段PCR扩增  55-56
      2.3.3 PCR扩增产物的检测  56
    2.4 细胞兴奋性肠毒素(alt)基因的检测  56-57
      2.4.1 引物  56
      2.4.2 目的片段PCR扩增  56-57
      2.4.3 PCR扩增产物的检测  57
    2.5 数据处理  57
  3 结果与分析  57-63
    3.1 气单胞菌毒力基因检测  57-61
    3.2 不同地区未发病池塘A.veronii毒力基因检测  61
    3.3 不同地区发病池塘A.veronii毒力基因检测  61-62
    3.4 不同地区发病池塘A.hydrophila毒力基因检测  62-63
  4 讨论  63-66
    4.1 气单胞菌毒力基因检测  64
    4.2 未发病池塘A.veronii毒力基因比较  64-65
    4.3 不同地区发病池塘A.veronii毒力基因比较  65
    4.4 不同地区发病池塘A.hydrophila毒力基因比较  65-66
第四章 维氏气单胞菌的遗传多样性分析  66-76
  1 材料  66
    1.1 实验材料  66
    1.2 试剂  66
    1.3 仪器和设备  66
  2 方法  66-68
    2.1 细菌DNA模板的制备  66
    2.2 细菌16S rRNA基因测序  66
    2.3 细菌gyrB管家基因测序  66-67
    2.4 细菌dnaJ管家基因测序  67-68
      2.4.1 引物  67
      2.4.2 目的片段的PCR扩增  67
      2.4.3 PCR产物测序  67-68
    2.5 数据处理  68
  3 结果与分析  68-70
    3.1 基于16S rRNA基因序列的A.veronii系统发育分析  68-69
      3.1.1 常州地区未发病池塘和发病池塘分离得到的A.veronii系统发育分析  68-69
      3.1.2 不同地区发病池塘分离出A.veronii系统发育分析  69
    3.2 基于16S rRNA、gyrB和dnaJ基因序列的A.veronii系统发育分析  69-70
      3.2.1 常州地区未发病池塘和发病池塘分离得到的A.veronii系统发育分析  69-70
      3.2.2 不同地区发病池塘分离出A.veronii系统发育分析  70
  4 讨论  70-76
    4.1 常州地区末发病池塘和发病池塘分离得到的A.veronii系统发育分析  70-71
    4.2 不同地区发病池塘分离出A.veronii系统发育分析  71
    4.3 利用不同基因序列分析A.veronii系统发育的比较  71-76
全文结论  76-78
参考文献  78-90
致谢  90-92
攻读学位期间参与学术会议、学术交流以及发表的学术论文目录  92

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产保护学 > 鱼病学
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