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马鼻肺炎灭活疫苗的研制及其免疫效果的研究

作　者: 王征
导　师: 曲娟娟
学　校: 东北农业大学
专　业: 微生物学
关键词: EHV 马鼻肺炎灭活疫曲间接ELISA 荧光定量PCR
分类号: S858.21
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

马鼻肺炎是马属动物的主要传染病之一,主要传播途径为接触性传播,即健康马匹通过接触排毒期马匹的排泄物,或与排毒期马匹共同进食,都会感染该病。该病病原分别是马疱疹病毒1型(Equine herpesvirus1,EHV-1)和马疱疹病毒4型(EHV-4)。感染EHV-4的患畜临床病征表现为呼吸道疾病、发热、食欲不振等；而感染EHV-1的患畜则更为严重,除表现出4型临床表征外,还会引起孕马流产、新生马驹死亡、神经系统疾病等症状。虽然感染马鼻肺炎后死亡率不高,但是其引起的后遗症会给种马、赛马等带来巨大的健康隐患。目前防制该病所采取的主要措施为疫苗免疫,通常为传统的灭活苗和减毒苗,国内目前还没有商品化的马鼻肺炎疫苗,因此,制备一株能够有效防制我国该病的疫苗则具有理论和实际意义的。本实验选取了2010年从黑龙江省分离到的马疱疹病毒,经测序分析,其gG基因与EHV-8亚型同源性高达99%以上,而其他几个影响病毒毒力的主要蛋白基因序列与标准EHV-1有90%以上的同源性。该毒株通过马体人工感染试验可引发马鼻肺炎临床表征。用该毒株经马胎皮细胞进行传代,稳定传10代后,病毒毒力保持在106TCID50/mL左右。用灭活剂β-丙内酯(BLP)灭活方法可直接作用于病毒核酸,不会破坏病毒蛋白结构,使被灭活的病毒保持较好的免疫原性；易水解,灭活后在37℃条件下水浴2h即可完全降解,水解产物为β-羟基丙酸。灭活后的病毒通过蔗糖密度梯度离心和超滤两种方式进行纯化,通过比较纯化后疫苗诱发的免疫效果可以看出,两者纯化效果相似,但是超滤方法更为简便。本研究分别建立了以纯化的疫苗株为抗原的间接ELISA及定量检测EHV-1、EHV-8DNA的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR进行检测免疫动物产生的抗体水平以及人工感染后的排毒情况。试验动物选择6周龄Balb/c雌鼠,分别于Od、17d和38d进行免疫,在三次免疫后取小鼠血清进行病毒中和试验,中和抗体效价可达1：100,并用马鼻肺炎病毒株攻击以及通过定量PCR检测小鼠肺组织内病毒DNA变化,、免疫组小鼠组织内病毒DNA含量要明显少于同时期的对照组小鼠。同时马体免疫试验结果也表明,该灭活疫苗能够诱导马产生具有抵抗强毒攻击的抗体水平。本实验制备的马鼻肺炎灭活疫苗能够有效的引起试验对象产生抗体,且其效价水平可达到抵抗疫苗株病毒攻击的保护标准。

全文目录

摘要  10-11
Abstract  11-13
1. 引言  13-21
  1.1 马鼻肺炎简介  13
  1.2 马疱疹病毒简介  13-16
    1.2.1 马疱疹病毒分离  13-14
    1.2.2 病毒的鉴定  14
    1.2.3 病原检测  14-15
    1.2.4 病毒粒子结构  15
    1.2.5 病毒生物学特性  15-16
    1.2.6 病毒理化特性  16
  1.3 马鼻肺炎流行病学  16-17
    1.3.1 国外流行情况  16-17
    1.3.2 国内流行情况  17
  1.4 马鼻肺炎的诊断与预防  17-19
    1.4.1 马鼻肺炎的诊断方法  17-18
    1.4.2 马鼻肺炎的预防  18-19
  1.5 疫苗株病毒  19
  1.6 目的与意义  19-21
2. 材料与方法  21-32
  2.1 细胞株、病毒株和实验动物  21
  2.2 实验所用菌种和质粒  21
  2.3 主要试剂  21-22
    2.3.1 主要酶类及生化试剂  21-22
    2.3.2 主要细胞培养试剂  22
  2.4 主要试剂的配制  22-23
  2.5 实验仪器  23
  2.6 灭活疫苗制备工艺  23-26
    2.6.1 疫苗株繁育  23-24
    2.6.2 疫苗株鉴定  24-25
    2.6.3 疫苗株灭活  25
    2.6.4 疫苗株纯化  25-26
  2.7 荧光定量PCR检测方法建立  26-28
    2.7.1 引物设计  26
    2.7.2 目的片段扩增  26-27
    2.7.3 标准品制备与标准曲线绘制  27
    2.7.4 特异性试验  27-28
    2.7.5 敏感性试验  28
    2.7.6 重复性试验  28
    2.7.7 人工感染BALB/c小鼠检测试验  28
  2.8 间接ELISA检测方法建立  28-30
    2.8.1 疫苗株病毒的纯化及浓度测定  28-29
    2.8.2 抗原包被浓度和一抗血清最佳反应浓度  29
    2.8.3 抗原包被时间选择  29
    2.8.4 一抗血清最佳孵育时间选择  29
    2.8.5 酶标抗体最佳工作浓度选择  29
    2.8.6 酶标抗体最佳孵育时间选择  29
    2.8.7 最佳显色时间选择  29
    2.8.8 间接ELISA特异性试验  29-30
  2.9 BALB/c小鼠保护模型  30-31
    2.9.1 小鼠抗体消长规律试验  30
    2.9.2 疫苗株感染小鼠试验  30-31
    2.9.3 小鼠血清病毒中和试验  31
    2.9.4 不同佐剂免疫效果试验  31
  2.10 马体试验  31-32
3. 结果  32-44
  3.1 灭活疫苗制备工艺  32-35
    3.1.1 疫苗株繁育  32-33
    3.1.2 疫苗株鉴定  33-34
    3.1.3 疫苗株灭活  34-35
    3.1.4 疫苗株纯化  35
  3.2 荧光定量PCR检测方法建立  35-38
    3.2.1 EHV-8 gB基因扩增  35
    3.2.2 标准品制备及标准曲线绘制  35-36
    3.2.3 特异性试验  36
    3.2.4 敏感性试验  36-37
    3.2.5 重复性试验  37
    3.2.6 人工感染BALB/c小鼠检测试验  37-38
  3.3 间接ELISA检测方法建立  38-40
    3.3.1 疫苗株病毒的纯化及浓度测定  38
    3.3.2 抗原包被浓度和一抗血清最佳反应浓度  38
    3.3.3 抗原包被时间选择  38
    3.3.4 一抗血清最佳孵育时间选择  38-39
    3.3.5 酶标抗体最佳工作浓度选择  39
    3.3.6 酶标抗体最佳孵育时间选择  39
    3.3.7 最佳显色时间选择  39-40
    3.3.8 间接ELISA特异性试验  40
  3.4 BALB/c小鼠保护模型  40-43
    3.4.1 小鼠体内抗体消长规律  40
    3.4.2 小鼠二、三免后抗体水平检测  40-41
    3.4.3 攻毒后小鼠体重变化  41
    3.4.4 攻毒后小鼠肺组织内病毒DNA含量测定  41-42
    3.4.5 小鼠血清病毒中和试验  42
    3.4.6 不同佐剂免疫效果试验  42-43
  3.5 马体免疫试验  43-44
4. 讨论  44-47
  4.1 灭活疫苗制备工艺  44
  4.2 荧光定量PCR检测方法建立  44-45
  4.3 间接ELISA检测方法建立  45
  4.4 BALB/c小鼠保护模型建立  45-46
  4.5 马体免疫试验  46-47
5. 结论  47-48
致谢  48-49
参考文献  49-55
附录  55-56
攻读硕士学位期间发表的学术论文  56

马鼻肺炎灭活疫苗的研制及其免疫效果的研究

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